Способ получения конъюгированного соединения, специфичного по отношению к клеткам меланомы

СО)ОЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИРЕСПУБЛИК 19) 111) 9604 АЗ 9 4 151)4 А 6 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК ПАТЕНТУ ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССС ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫ(72) Франц Клаус Янсени Пьер Грос (ГЙ)(56) Ргосеед 1 пдз о йЬе йаопаАсас 1 еву оЕ Баепсез оГ СЬе ОБА,1980, 77(4), р,2183-2187,,3 оцгпа оГ Во 1 од 1 са 1 СЬеп),1974 (11), р.3557-3562.Заявка Франции У 2437213,кл. А 61 К 39/395, 1980.Заявка Франции У 2466252,кл. А 61 К 39/395, 1980.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГИРОВАННОГО СОЕДИНЕНИЯ, СПЕЦИФИЧНОГО ПООТН 0111 ЕНИЮ К КЛЕТКАМ МЕЛАНО 1 Ф(57) Изобретение относится к областмедицины и может найти применениепри получении соединений, ингибирую щих рост и развит)е меланом, Цельюизобретения является повышение терапевтической активности препарата.Для получения конъюгированного соединения комплексируют цепочку А Рицина (Р) с антителом к меланоме человека (АТ), Р обладает цитотоксической активностью, АТ способно селективно распознавать антиген рако.вых клеток. Перед конъюгацией АТ обрабатывают 3-(2-пиридилдисульфанил)пропионовой кислотой в буферном растворе в присутствии карбодиимида.Обработку проводят в течение 20 чпри температуре 30 С. Модифицированные таким образом АТ конъюгируют сР в течение 20 ч при температуре25 С. Полученное соединение очищаютот примесей традиционным способом.Соединение обладает значительнойспецифичностью действия по отношению к клеткам меланомы и безвреднодля здоровых клеток. Питотоксическаяактивность соединения в 400 раз выше, чем цитотоксическая активность Р.296042на необходимо, чтобы каждый из этихпротеинов имел либо тиоловую группу,либо активированную дисульфиднуювгруппу. 20 Ъ Ю Ае - ЯН 2+НОС - СН 2 СИ 2 - 5 - 5 -А-ЮН- С - СИСН - 5-5-фО Ц Норганического растворителя, смешиваемогс с водой, такого как спирт, а кокретнее, третичый бутанол,Реакпню осуществляют при температуре окружающей среды в течение време 45 55 Изобретение относится к медицине, в частности к способу получения противоопухолевых препаратов, и может найти применение при получении соединений, ингибирующих рост"и развитие меланом.Целью изобретения является повышение терапевтической активности препарата за счет специфичности доставки противоопухолевого вещества к опухолевым клеткам.Для получения конъюгированного соединения используют цепочку А Рицина, обладающего цитотоксической ак. тивностью, и соединяют ковалетной связью дисульфидного типа с антителом антимеланомой человека, способттттт селектнвно распознавать антиге раковых клеток.Пля создания дттсульЬттдттой связи между антителом и цепочкой А Рицигде А - вн гтттелс атттттттеланома;цепочка А - цепочка А, Рицина;(1) - модифицированное антитело,есущее активированную дисулт-фтлдттую группу.Реакцию соединения реактива с иммуноглобулином осуществляют в жидкой гомогенной среде, чаще в воде или в буферном растворе.,застя растворенияслучае еобходимости вводят в реакт 1 ттоттттую среду по 20 об.7 ни, изтлеяюше.лся от;с.кольких часов до 24 ч.Пос.л этого ". помощью диализа удаляют еее,";т ения, меюшие низкую ттолекузярую массу и, в частности, избыток реагетоа,Соелттттентфе с ттепочкой А Рициа осуществстяют в водттом растворе двух белков при темпер этторе., не превтттцаюсвсей 30 С, в -.ечет;е времетти, равном от несксстьтсттх т;тров до целого дя. Полученттй раствор подвергают дтталттЦепочка А Радина имеет тиоловуюгруппу, способную вступать в реакциюфАнтитело антимеланома не содержитни Функции свободного тиола, ни других атомов серы, пригодных для реакции сочетанияДля введения активированных дисульфидных групп антитело 15 модифицируют реактивом, вступающим вреакцию с химической группой, суще - ствующей в молекуле, а именно: с группой ЙН боковых цепей лизиновых атиттоктслот, имеющихся в молекуле. Схематично эти реакции можно выразить следующим образом: зу для удаления соединений с низкой молекулярной массой, после чего коньюгированное соединение очищают любым известным методом.П р и м е р 1. Антитело антимеланома, направленное против антигена Р 97 меланомы человека получают традиционным способом. Последнюю очистку осуществляют с помощью диалиэа против буферного раствора РВ 5 (10 мМ Фосфата, 140 мМ хлорида натрия, рН 7,4Пля получения цепочки А Рицина иэ предварительно измельченных зерен В 1 сстпстз сопттттстп 1 з зкстрагируют масло путем многократной обработки зерен этиловым эфиром при температуре не выше 4 С. После отгонки эфира и сушки полученный порошок суспендируют в растворе хлорида натрия, подкисленном до рН 4. Суспенэию экстрагируют на холоду при перемешивании раствором хлорида натрия, экстракт диализируют сначала водой, затем буфером с евысокой ионной силой ТВ 15-НС 1, 1 О мМ, рН 7,7. Диализный осадок отделяют фильтрацией.Получают сырой раствор, содержащийпротеины. Очищают полученный растворабсорбционной хроматографией на колонке иэ Сефароэы, уравновешеннойбуфером ТК 15-НС 1, 10 мМ, рН 7,7,охлажденным до 4 С. Элюенты: буферТВ 5-НС 1, 10 мМ,рН 7,7, и этот жебуфер в смеси с галактозой.Очищенный раствор Рицина концентрируют ультрафильтрацией на пористой мембране, Получают чистый раствор Рицина в буфере.Для выделения цепочки А Рицинаочищенный раствор обрабатывают восстановителем, например 2-меркаптоэтанолом на колонке с ионообменной полисахариднэй матрицей например, ДЕАЕСефароэы 6 В, уравновешенной буфером ТК 15-НС 1, 0,1 М, рН 8,4, содержащем упомянутый восстановитель, Двецепочки А и В рицина фиксируются наколонке эа счет онной связи с группами ДАЕА, а цепочка В фиксируетсятакже эа счет сродства к матрице Се -фарозы.Элюирование цепочки А осуществляют буФером ТК 15-НС 1, О,1 М, рН 8,4,содержащим МаС 1 0,1 М и 2-меркаптоэтанол с концентрацией 2,57. Получают фракцию, содержащую цепочкуА Рицина, идентифицированную электрофорезом. Эту фракцию диализируют наколонке с карбоксиметилцеллюлозой,уравновешенной фосфатным буфером10 мМ, рН 6,5, мол.м.полученной цепочки А Рицина = 300003000; изоэлектрическая точка: 7,5,Для модиАикации антитела антимеланомы к 0,5 мл раствора, содержащего20 мг/мл 3-(2-пиридилдисульфанил )пропионовой кислоты в третичном бутаноле, прибавляют 0,2 мл раствора,содержащего 60 мг/мл 1-этил-(3-диметиламинпропил,1-карбодиимида, иоставляют смесь на 3 мин при температуре окружающей среды.30 мл полученного таким образомраствора прибавляют к 1,66 мл раствора антитела антимеланома, содержащегося в количестве 2,4 мг/мл вбуферном растворе РВ 5. Инкубационный период составляет 20 ч при 30 С.Затем непрерывно осуществляют диализ раствора в течение 3 ч против21 л буферного раствора РВ 5 при температуре 4 С. Таким образом получают 4 мг активированного антителапри концентрации 2,3 мг/мл,10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 С помощью спектройотометрического анализа по длине волны 343 нм освобожденного 2-тионпиридина с исполь- . зованием восстановленного глютатиона устанавливают, что получено антитело, несущее 2,6 групп-активаторов на моль антитела. Для получения конъюгированногосоединения к 1,3 мл раствора активированного антитела в буферном растворе РВ 5 (концентрация 2,3 мг/мл или3 мг активированного антитела прибавляют 0,52 мл раствора цепочкиА Рицина, взятой в том же самом буФерном растворе (концентрация5,8 мг/мл). Инкубируют в течение20 ч при 25 С.Реакционную смесь подвергают хроматографии на колонке с гелем 5 ерЬадех С 100. В каждой фракции определяют концентрацию антитела с помощью спектрофотометрии на длиневолны 280 нм и концентрацию цепочки А по ее ингибиторной способности по отношению к протеосинтезу, измеренную на клеточной системе. Идентичные фракции, содержащие конъюгированное соединение, объединяюти получают таким образом примерно1 мг соединения с концентрацией0,2 мл/мг,Осуществленный анализ позволилвыявить, что раствор содержит50 мг/мл биологически активной цепочки А или примерно 1,4 моля цепочкиА на моль антитела.Исследование, осуществленное спомощью цитофторометрии, помимо того, позволило выявить, что использованное антитело антимеланома, соответствукицее активир,званное антителои конъюгированное соединение этогоантитела с цепочкой А Рицина составляют очень близкие гистограммы флуоресценции. Это свидетельствует отом, что антитело не испытывает никакого значительного изменения втечение реакций активаций и соединений, которым оно было подвергнуто,в частности что оно остается способным, даже находясь в общем соединении, распознать антиген Р 97, про"тив которого оно и направлено.П р и м е р 2. Полученное соединение исследуют в отношении егоантиракового действия.Определение ингибирования протео"синтеза.Основным биологическим свойством цепочки А Рицина является ингибирование (торможение ) клеточного протеосинтеза с помо 1 чью изменения субьединицы рибоэомаля 60 5. 5Используя модель клетки, определяют эффект изучаемых веществ на внедрение С-лейпина в клетки, пораженные культурой рака.Используемые клетки принадлежат к клеточному потомству М,1477, полученному из меланомы человека, имеющую антиген Р 97. Эти клетки после трипсинации подвергают предварительной инкубации в течение по меньшеймере 24 ч с тем, чтобы допустить новое проявление поверхностных антигенсв, когсрые воэможнс изменились.После присоединения изучаемого вещесгва осуществляют новую инкубацию.По окончан 11 и инкубации приступаю 1 кизмерени 1 о степени включения "4 С-лейцпна обработанным яаким образом клетками. 20 Это изменение проводят в соответствии с радиционной методикой используя индикатор 4 С-лейцина для определения сгепени протеосинтеза, Опрс 1 еление Г 10 лученной радиоак зигно ги о уществляюг в данном слу 30 чае на ц: л 1 х изолированных ф 1 льтраванием клетках.Ло окончании этих определений строят гр,.1 ьит зависимости эффекта от дозы (ло абсцпссе откладь 1 вают концентрац 1 оо изучаемьгх веществ, а по ординате откладывают внедрение 14С-лей.1 ина, выраженное в процснгах ло отношениювнедрению в сравниваемые кле ки пр 11 отсутствии изучаемого веществ; ).Из графика;.,;ределя 1 от для каж -дого изуч;:емого вещества концентрацию, прн к;.г:рзй происходит 507 внедрения 4 С-лс.йц 1 И 1; 1 г 11 тормозящая14,концентрация 50 ,С 1 50).В результате определения установлено, что полученное кояъюгированноеоединенне обл;, ьт ".1 льиой цитоксичной активностью .1 50 . 5 10 М ),т. е. прв 1 грно в -100 раз более значительной, чем цитоксичная активностьцепочки А Рицина.Торможгние образования колоний,Клетки с культурой меланома55М 1477 огк 1 еивают от их подложки спомощью расгвора 17 егзепе (буферныйраствор Р 115, содержащий этилендиами 11 гетрауксусную кислоту) или с помощью трипсинизаиии. Этими клетками за - севают (из расчета 210 клеток на чашку Петри, имеющую диаметр 5 см ) среду следующего состава: среда РРМ 1 1640 (Мег)сцх) с добавкой глутамина 2 мМ, бикарбонат натрия 2 г/л, 15 Е инактивированной зародышевой сыворотки теленка (5 егснпеО) и антибиотика пеницилин, стрептомицин и амфотерицин В ).Через 24 ч клетки обрабатывают различными концентрациями полученного по примеру 1 соединения.Для сравнения аналогичную серию экспериментов проводят с Рицином, с цепочкой А Рицина и с неспецифичным конъюгированным соединением этого клеточного потомства (общим с цепочкой А Рицина и антителом анти-ОМР/Р 5 10).По истечении,24 ч среду культурыудаляют и заменяют на такую же свежую среду без какой-либо цитотоксичной субстанции,Через 10-15 дней число развившихся колоний определяют по окраске спомог 1 ью раствора фиолетового кристалла и втомстического счетчика колоний (система Артек 880),Э гот метод позволяет обнаружитьгакие низкиеколичества, как 10 жизне-способных клеток на чашку а такжеосуществить проверку, используя контрольные культуры. Таким образом выявлено, что образование колонийстрого пропорционально начальнойконцентрации клеток, по меньшеймере в пределе от 10 до 104 клеток на мл.В результате эксперимента установ -лено, что полученное коныогированноесоединение обладает высокой активностью, так как последняя клетка меланома убита при концентрации, приблизительно равной 2 10 7 М общего соединения. Эта концентрация совершенно соавнима с концентрацией Рицина ( 10 м ), тогда как для цепочки А Рицина необходима концент - рация 10М для достижения аналогичного эффекта. Кокъюгированное соединение совершенно не проявляет активности при концентрации ниже 2 10 8 М,Результаты этого эксперимента полностью подтверждают результаты, по1329604 подвергают взаимодействию с цепочкой А РицинаСоставитель В.РомановаРедактор А.Ворович Техред М.Ходанич Корректор М.1 ароши Заказ 3498/58 Тираж 595 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д,4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул. Проектная, 4 лученные при исследовании торможения протеосинтеэа,Таким образом, соединения, полученные согласно изобретению, облада 5ют значительной специфичностью действия по отношению к клеточному потомству меланомы человека. Эти соединения могут быть использованы прилечении меланом человека и возможно 1 Одругих раковых заболеваний, которыеподвергаются воздействию используемого антитела.Эти конъюгированные соединенияопределены для использования в виде 1 Бинъекций, Они могут применяться либоотдельно, либо в сочетании с другими лекарствами, показанными для раковых заболеваний, и, в частности,в сочетании с другими иммуноподавляющими медикаментами для замедления иослабления естественной иммунной реакцйи пацинента в отношении посторонних веществ в его организме, которыми являются конъюгированные соединения. Ставя целью полностью удалить раковые клетки, лечение должно осуществляться при использовании достаточной дозы конъюгированного вещества, а продолжительность лечения должна быть определена в каждом отдельном случае в зависимости от причины и природы иэвлечиваемого заболевания. Формула изобретения Способ получения конъюгированного соединения, специфичного по отношению к клеткам меланомы, о т л и " ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения терапевтической активности препарата, антитела к меланоме, обработанные в присутствии водорастворимого карбодиимида соединение фор- мулы