Штамм вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом 2-го серотипа, используемый для специфической лабораторной диагностики

Скачать ZIP архив.

Текст

7 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ АВТОРСКОМУ СВИ 23, 07, 90, Бюл. У 23928803/28-13(71) Институт полиомиелита и вирусныхзнцефалитон АМН СССР(56) Н,. .ее, Р .ее, К.М. ЗоЬцяоп 1978. 1 яо 1 аоп оГ е".о 1 о 8 деа 8 епт. оГ Еотеап ЬешоттЬа 81 с теЬет.(54) ШТАММ ВИРУСА ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙЛИХОРАДКИ С ПОЧЕЧНЬМ СИНДРОМОМ 2-ГОСЕРОТИПА, ИСОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ(57) Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано длялабораторной диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). Целью изобретения является получение нового штамма вирусагеморрагической лихорадки с почечнымсиндромом 2-го серотипа.Штамм УФАСС"1820 вируса ГЛПС получают путемпоследовательного пассирования суспензии легочной ткани рыжей. полевки,отловленной в природном очаге ГЛПСв г. Уфе, иа культуре клеток 7 ККО-Е 6.. Штамм хранится н Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И. Инановского под номером ГКВи характеризуется следующими признаками, При электронно-микро скопическом изучении инФицированных клеток 7 ЕКО-Е 6 выявляются частицы ок 3 руглой формы с диаметром около 10 нм, окруженные липопротеиноной оболочкой. . Вирус размножается в культуре клеток 7 ЕКО-Е 6 при 370 С, рН - 7,2-7,8, множественность заражения составляет не менее 0,1 ннрусной частицы на клетку, максимальный титр вируса обнаруживается на 12-14 день заражения и составляет ,0-6,0 1 о 8 ИДоидФ В крови зараженных животных с 10 дня после заражения накапливаются специ-. фические антитела к вирусу ГЛПС. Для выявления специфических антител к ви- С русу ГЛПС исследуемые сыворотки крови больных людей наносят на предметные стекла с антитеном вируса УФА ивй СС. Основанием для постановки САр лабораторного диагноза служат резуль-таты метода флуоресцирующих антител, (руказывающие на четырехкратное или бо- р лее значительное нарастание титровспецифических антител к вирусу ГЛПво вторых сыворотках, 1 табл.1 131955 2Изобретение относится к вирусоло- слоя, Затем во флаконы добавляютгии и может быть использовано для ла мп свежей питательной среды с 10 Хбораторной диагностики геморрагичес- нормальной телячьей сыворотки,(НТС)кой лихорадки с почечным синдромом.проводят в этом объеме суспендироЦелью изобретения. является получе ванне клеток. Взвесь инфицированныхние нового штамма вируса геморрагн- клеток в объеме 0,2 мл смешивают с .ческой лихорадки с почечным синдро- . Равным объемом суспензии свежих нормом 2-ого серотипамальных клеток АЛЕКО-Еб, обеспечиваяДанный штамм получают следующим необходимую концентрацию клеточнойобразом. 0 суспензии (50000-60000 клеток в 1 мл)Легочную ткань самца рыжей полев- добавлением среды Игла 2-МЕМ с 10 Хки возраста 11-12 месяцев трижды от- НТС. Через 2 сут, инкубирования примывают в физиологическом растворе , 37 С во флаконах заменяют среду рос-о(0,85 Х ВаС 1), содержащем антибиотики та на среду поддержания роста клетокпенициллин, стрептомицин, канамицин15 и продолжают инкубировать клетки приов концентрации 500 ЕД/мл, 250 мкг/мл 37 С в течение еще 10 дней. Субкульи 500 Ед/мл соответственно). Затем тивирование инфицированных клетокткань помещают в стерильную ступку АЛЕКО-Еб проводят в дальнейшем по анан тщательно растирают в присутствии .логичной методике с 12-дневным интернебольшого количества стерильного 20 валом,песка. Добавляют физиологический ра- Начиная со 2 пассажа часть инфициствор с 2 Х нормальной телячьей сыво- Рованных клеток наносят на предметротки из такого расчета, чтобы полу- ные стекла и исследуют их на.присутчить 10 Х-ную суспензию легочной тка- ствие специфического флуоресцирующени (на 1 г легких добавляют соответ-го антигена вируса геморрагическойствеино 1,0 мл физиологического раст- лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС),вора). Легочяую суспенэию отсасывают. На уровие 2-го пассажа специфическоестерильной пипеткой и переносят в ин- свечение ачтигена вируса ПП 1 С обнарусулиновый флакон, который помещают живается лишь в отдельных единичныхв низкоскоростную центрифугу, После 30 клетках в поле эРениЯ. ОтмечаетсЯпентрифугирования при 6000 об,/мин в цитоплаэматическая локализация антитечение 30 мин надосадочную жидкость гена вируса ГЛПС, преимущественно восторожно извлекают и используют для перинуклеарной зоне инфицированныхзаражения .клеточной культуры. клеток, для которого характерно неждля заражения используют клетки 35 ное желто-зеленое мелкозернистое свеЧЕРО-Е 6, которые выращивают в 50 мл .чение, По мере адаптации вируса вфлаконах до образования полного моно- пассажах наблюдается образование бо-,слоя. Осветленную 10 Х-ную суспенэию лее крупных гранул, равномерно заполлегочной ткани вносят в ч флакона по няющих всю цитоплазму клеток. Специ 0,2 мл в каждьй. После контакта ино фическое свечение определяется каккулята с клетками при 37 С в течение,ярко-зеленая люминесценция на фонечО мин. монослой клеток дважды отмы- непораженных клеток кирпичного цвевают средой Игла и во флаконы добав- та. Количество антигенположительных "ляют среду для поддержания роста кле- клеток заметно возрастает от пасса-ток (среда Игла 2-МЕМ с 2 Х нормаль жа к пассажу и составляет 90-100 Х кной телячьей сыворотки), Инкубирова-6 пассажу. Цитопатического эффектас1ние инфицированных культур клеток .в инфицированных культурах не наблюпроводят в термостате при 37 С, дается. На уровне б пассажа суспенЧерез 12 дней с момента инокуля- зии инфицированных клеток разливают.ции клеток культуральную жидкость 50 по 0,5 мл во флаконы и хранят присливают,клеточный монослой дважды -60 С. В дальнейшем эти суспензияотмывают раствором Хенкса и обрабаты- используют в качестве посевного вивают последовательно 0,25 Х-ным раст- руса и обозначают как штамм УФА.ССвором трипсина (2 мл на флакон) и . 1820,.0,02 Х-ньа раствором версена (2. мл, 55 Штамм УФА ССхранится в Гона флакон) по 2 мин каядым. Послесударственной коллекции вирусов Ин-.удаления версена флаконы с клетками ститута вирусологии им. Д.И. Ивановинкубируют в термостате при 37 С до ского АМН под номером ГКВи хапоявления признаков разрыхления моно- рактериэуется следующими признаками,1315 3Морфологические признаки.Прп электронно-микроскопическомизучении клеток ЧЕКО-ЕЬ инфицированных штаммом УФА ССвируса ГЛПС,выявляются частицы округлой илиовальной формы с диаметром в среднем100 нм, окруженные хорошо контурирующейся липопротеиновой оболочкой.Иор,фология частиц сходна с морфологией1 вирусов семейства Буньявириде. ВмесЭте с тем очевидно, что некоторыеособенности морфологии и морфогенеза свидетельствуют об его определенн й таксономической обособлениости отвирусбв известных четырех. родов это 5го семейства,Биологические признаки,Оптимальная множественность заражения клеток ЧЕКО-ЕЬ штаммом УФАССсоставляет не менее О, 1 вирусной частицы на клетку. Оптимальной температурой размножения штамма,рН от 7,2 до 7,8. Иаксимальный титрвируса. при заражении культуры клеток ЧЕКО-ЕЬ составляет 5,0-6,01 о 8 ИД ; сроки максимального накопления "луоресцирующего антигенавируса ГЛПС составляют 12-14 дней.Инфекционные признаки,При введении штамма УФА ССвируса ГЛПС лабораторным животным(взрослые белые мыши, белые крысы,морские свинки, кролики) клиническихпроявлений заболевания и их гибелине наблюдается в течение всего срока наблюдения за животнымл (до 3-хмесяцев с момента инокулирования вируса), Вместе с тем, начиная с 10дня после заражения, в их крови обнаруживается накопление специфических антител к вирусу ГЛПС. Оптимумнакопления антител определяется к25-30 дню с момента их заражения. Таким образом, экспериментальные животные могут быть использованы для иммунизации и получения иммунных антиГЛПС сывороток, но не для пассирова"ния живого вируса.Полная,инактивация инфекционнойактивности штамма УФА СС.вирусаГЛПС происходит при его нагреваниипри 60 фС в течение 30 мин н при обработке ультрафиолетовым облучением(бактерицидные лампы) в течение 2 ч.Антигенная активность в первом случае снижается в 4 раза, а во второмслучае остается без изменения 54Хранение вирусного штамма осуществляется в виде суспецзин инфицированных клеток ЧЕРО-Еб с добавлением5 Х НТС при температуре -60"С, При таком режиме хранения вирусцьпт штамм не теряет своей инфекционной и антигенной активности в течение 1 года(срок наблюдения).Использование штамма УФА ССдля специфической лабораторной диагностики, иллюстрируется следующим примером.Для заражения вирусом используют суспензию клеток ЧЕКО-ЕЬ, После внесения вируссодержащей суспензии во флаконы с взвесью клеток их помещают в термостат при 37 фС. Культивирование вируса ГЛПС в клетках осуществляют в. течение 12-14 суток.1На 12-14 сутки с начала инфицирования клеток ЧЕКО-Е 6 вирусом ГЛПС, монослой клеток последовательно обрабатывают раствором трипсица ц версена, после чего проводят суспецдирование ицфицироваццых клеток в неболь- шом количестве физиологического ра" створа, Конечная концентрация клеток должна состалять 300-400 тысяч в 1,0 мл.Аналогичным образом готовят суспензию нормальных неинфицированных клеток ЧЕКО-Е 6, Суспецзии инфицированных и нормальных клеток сме 1 пиэают в равных объемах и раскапывают на предметные стекла по 3-5 мкл на каждый мазок, После полного высыхания суспензий препараты фиксируют в охлажденном ацетоне в течение 15. - ,.20 мин и затем обрабать 1 вают ультрафиолетовым облучением для ицактивации инфекционной активности вируса, Приготовленные таким образом антигенные препараты до использования хранят при - 60 С.Для выявления специФических антител к вирусу ГЛПС исследуемые сыворотки крови больных людей наносят на предметные стекла с антигеном вируса ГЛПС. Сыворотки обследуют методом флуоресцирующих антител в разведениях 1:6 и вышеПрепараты помещают во влажную камеру и вьдерживают при 37 С,в течение 30 мин, и затем стекла трехкратно промывают 0,01 М фосфатным буферным раствором и сушат при комнатной температуре, На препараты наносят люминесцирующую сыворотку против глобулинов человека в рабочем разведении, которое оп1319554 6Выявлениеантител к вирусу ГЛПС всыворотках крови больных с помощьювирусного антигена штамма УФА СС 1820 2-ого серотипа методом МФА ределяют в предварительном опыте. Вкачестве контрастера используют раст.вор Голубого Эванса в конечной концентрации 1: 10 000. Препараты вновьинкубируют во влажной камере при тем" 5 пературе 37 С в течение 30 мнн, затем промывают их, высушивают и реги.стрируют е помощью люминесцентного микроскопа.Для вируса ГЛПС характерналокали эация флуоресцирующего антигена с четкой гранулярной структурой в цито- плазме клеток, Яркое изумрудно-зеленое гранулярное свечение антигена вируса ГЛПС просматривают на фоне кир пичного окрашивания структуры нормальных неинфицированных клеток, Такой же .кирпично-красный фон отмечают и на мазках с нормальной сывороткой, используемой в качестве контроля. 20Титром сыворотки считают ее наивысшее разведение, способное еще выявлять специфический антиген вируса ГЛПС, Для постановки серологического 1 диагноза обследуют две сыворотки кро. ви.от каждого больного. Первую сыворотку получают тотчас же после выявления заболевания, а вторую - через3-5 дней после забора первой. Основанием для постановки лабораторногодиагноза.служат результаты полученные с помощью метода флуоресцирующихантител (МФА), указывающие на четырехкратное или более значительное нарастание титров специфических антител 35 к вирусу ГЛПС во вторых сыворотках.1Результаты МФА представлены в таблице. Титры сывороткив МФА с антигеном штамма УФАСССыворотки День бокрови боль- лезниных ГЛПС 1837 (УФА) 1:5121:20481:16384 16 1842 (УФА) 1 ф 1024 1: 8192 14 1865 (Устинов) 1;2561 ф 10241 ф 4096 30 974 (Владивосток) 1:32 16 1: 128 1022 (Хабаровск).Формула изобретения 1: 16 1:64 Штамм вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом 2- госеротипа, ГКВ Р 706 (Государственная коллекция вирусовИнститута виру 700047 (Ко сологии им, Д.И.Ивановского АМН СССР)рея) ,используемый для специфической лабораторной диагностики.37 1:16 Составитель М. СероваРедактор М. КузнецоваТехред Л.Олийнык Корректор М.Демчик Заказ 2489 Тираж 494 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб , д, 4/5

Смотреть

Заявка

3928803, 10.07.1985

ИНСТИТУТ ПОЛИОМИЕЛИТА И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ АМН СССР

БАШКИРЦЕВ В. Н, ТКАЧЕНКО Е. А, ДЗАГУРОВА Т. К, РЫЛЬЦЕВА Е. В, ДРОЗДОВ С. Г, СТЕПАНЕНКО А. Г

МПК / Метки

МПК: C12N 7/00, A61K 39/12

Метки: вируса, синдромом, серотипа, специфической, используемый, почечным, лихорадки, лабораторной, штамм, 2-го, диагностики, геморрагической

Опубликовано: 23.07.1990

Код ссылки

<a href="http://patents.su/4-1319554-shtamm-virusa-gemorragicheskojj-likhoradki-s-pochechnym-sindromom-2-go-serotipa-ispolzuemyjj-dlya-specificheskojj-laboratornojj-diagnostiki.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Штамм вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом 2-го серотипа, используемый для специфической лабораторной диагностики</a>

Похожие патенты