Способ получения вещества, обладающего антипротеазным действием

рственн ЕЩЕСТВА, ТЕАЗНЫМ Комитет Россиискои Федераци о патентам и товарным знакам авторскому свидетельств(71) Читинский госуда ый медицинский институт(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОБЛАДАЮЩЕГО АНТИПРОДЕЙСТВИЕМ(57) Изобретение относится к медицине имедицинской промышленности, в частностик способам получения ингибитора протеазы ырья животного происхождения. Цель 19) КЮ (11) 1823184 (1 з) А 1 изооретения - упрощение спосооа чения выхода целевого продукта. ленная цель достигается те околоушные слюнные железы живо могенизируют. экстракцию проводят в растворе уксусной кислоты при соотношении ткань: кислота 1:8-1:10 с добавлением хлористого цинка в количестве 1 г на 1 л смеси при рН 3-3,5, температуре +4-8 С в течение 36-60 ч, экстракт фильтруют. фильтрат обрабатывают ацетоном в соотношении 1:5 при температуре -5-+5 С в течение 18-22 ч, полученный осадок. содержащий целевой продукт, растворяют в дистиллированной воде, фильтруют на цеолите и лиофилизируют.Изобретение относится к медицинской промышленности и касается выделения биологически активных веществ из сырья животного происхождения, обладающих антипротеазным действием.Цель изобретения - упрошение способа и увеличение выхода целевого продукта,Способ осуществляется следуюшим образом.Используемые в качестве сырья около- ушные слюнные железы крупного рогатого скота получают на мясокомбинате, причем забор сырья вписывается в технологическую цепочку забоя. Полученное сырье здмораживают при температуре -12 - -18 С. Свежездмороженные железы гомогенизируют на волчке. Гомогендт здливдют раствором уксусной кислоты, содерждшим 1 г хлористого цинка на 1 л смеси до рН раствора 3,0-3,5. Соотношение ткань:кислота должно оыть 1:8-1:10. Экстракцию проводят при температуре +4 - +8 С в течение 36-60 ч при постоянном встряхивании. По окончании экстракции надосддочную жидкость декантируют, Полученный супернатант фильтруют через бязевую ткань, К фильтрату добавляют ацетон в соотношении 1:5 при температуре -5 - +5 С, перемешивают и формируют осадок в течение 18-22 ч. Осадок промывают в ацетоне и высушивают. Порошок растворяют в дистиллированной воде, перемешивают и фильтруют через цеолитовый фильтр. Фильтрат лиофилизируют.Полученное вещество представляет собой комплекс полипептидов с молекулярной массой 2000-10000 Д. Полипептидная природа вещества, полученного по предлагаемой методике, подтверждается следующими данными:1) дает цветную реакцию с биуретовым реактивом;2) молекулярная масса компонентов, определенная с помощью гель-хроматографии составляет 2000-10000 Л;3) аминокислотный анализ вещества показал, что в состав полученного продукта входит 20 видов аминокислот в определенном соотношении;4) основной спектр (пик) поглощения в ультрафиолетовом свете колеолется в пределах 220-230 нм (спектрофотометрически),Вышеуказанное позволяет достаточно точно провести идентификацию полученного вещества.При сопоставительном анализе заявляемого способа и способа-прототипа выявлены следующие сходные признаки:1) обд спосоод используют для получения вешествд, оолддаюшего днтипротедзным действием2) используют животное сырье;3) сырье гомогенизируют;4) гомогендт подвергают экстрдкции;5) экстракт фильтруют;6) полученное вещество лиофильно высушивдют.Одндко, известный предлагаемый способ отличия:1) В качестве способ-прототип и имеют след юшие сырья в прототипе используют поджелудочную железу, д в предлагдемом способе - околоушные слюнные железы.Поджелудочную железу применяют в качестве сырья для получения гормонов и других биологически активных веществ, в то время кдк используемые в предлагаемом спосоое около шные слюнные железы в ндстояшее время являются отходом производства.2) В предлагаемом способе сырье предварительно замораживают с целью разрушения клеток околоушной железы, что приводит к увеличению выхода конечного продукта (см.табл. 1).3) Для получения экстракта, содержащего вещество, обладающее антипротеазным действием, по способу-прототипу экстракцию предварительно измельченного сырья проводят 60-70, раствором этилового спирта при рН 3,0-4,0; экстракт упаривдют до содержания спирта 10-30;4, охлаждают до 5-10 С и инкубируют в течение 2-6 ч, д целевой продукт отделяют сифонированием, сорбируют на сульфокатионите КУИ, промывают раствором 0,1-0,5 М ХН 4 С с рН 9,5-10,5; десорбируют 0,01-2,5 М рдствором ХдС с рН 12,0-12,5; а перед осаждением ацетоном подкисляют до рН 1,0-3,0; фильтруют.В то время, кдк по предлдгдемому способу, для получения экстрактд, содерждшего вешество, обладающее антипротеазными свойствами, замороженное сырье гомогенизируют. Экстракцию проводят раствором уксусной кислоты при соотношении ткань:кислота не менее 1:8-1:10 с добавлением хлористого цинка в количестве 1 г/л смеси при рН 3,0-3,5. Обработка гомогендта сырья раствором уксусной кислоты с добавлением хлористого цинка позволяет осддить агрегируюшие при заданных (3,0-3.5) зндчениях рН белки и провести гидролиз крупных оелков, Тдк кдк измельченная тк.нь оолдлает склонностью к ндбухднию, то 1 ля более полного выделения активного вещества дляэкстрдкции берут не менее 8-10 оаъемов уксусной кислоты относительно гомогенатд ткани. Экстракцию проводят в течение 36-60 ч при температуре +4-+8 С, что также способствует гидролизу крупных белков, Лекднтация надосддочной жидкости позволяет отделить экстракт от осадкд, не прибегая к процессу сорбции. Для дальнейшего очищения экстракта от крупнодисперснаго осадка, включающего агрегированные оелки, не облддаюшие специфической активностью (антипротеазное действие), его фильтруют.Доказательства правильности выбранных в предлагаемом способе пардметров экстракции приведены в табл. 2-6,Из табл. 2 видно, что для получения вещества аалдддюшего днтипратедзными свойствами, с молекулярной массой 2000- 10000 Д, необходима концентрация хлористого цинка 1 г/л,Из табл, 3 видно, что ндилучшие результаты экстракции полипептидов наблюддются при рН 3,0-3.5. Более высокие значения рН приводят к недостаточному выходу вещества с более высокой молекулярной массой, а при более низких значениях рН усиливается гидролиз пептидов.Так как измельченная слюнная железа обладает склонностью к набуханию, то, как видно из таблицы 4 для более полноговыделения активного вещества для экстракции берут не менее 8-10 объемов кислоты относительно количества сырья.Из таблицы видно, что оптимальная экстракция вещества с молекулярной массой 2000-10000 Д происходит в течение 36-60 ч. Снижение времени экстракции приводит к уменьшению выхода целевого продукта, а увеличение - к гидролизу пептидов. Из таблицы 6 следует, что экстракция, при которой наблюдается оптимальный выход вещества с молекулярной мдссой 2000-10000, происходит при температурном режиме +4 - +8 С,Полученный в результате вышеописанного процесса экстракт целесообразно разделять с осадком гомогената путем декднтации, что значительно упрощает дальнейший процесс фильтрации, Фильтрация через бязевую ткань позволяет освободить экстракт от балластных вешеств.Экстракция по заявляемому способу значительно упрощает технологию выделения ингибиторов протедз. Для выделения используют экстрагиравдние при ог ределенных ъславиях, не треб 1 ющее специа зьнага ааарудовдния, Экстрдкция па заявляемом способу исключдст ряд этапов па срдвнению со способом-прототипом; вакуум-дистилляцию, охлдждение, сифониравание, фильтрдцию под давлением на рамном фильтре через плдстины "Хеи (ФРГ). То есть. для получения экстракта и дальнейшей его подготовки к выделению и очистке в здявляемом способе используется значительно меньше этапов.4) Для выделения активных палипептидов, облддаюших днтипротеазными свойствами, их дальнейшей очистки, по способу-прототипу ингибируюшие фракции выделяют из фильтрата путем пропускдния через колонку, заполненную макропористым сульфакатионитом КУИ синтезированного нд основе стирала и дивинилбензодд, после окончания сорбции сульфокатионит промывдют раствором МН 4 С 1, ингибитор пратедз десороируют из ионита водным раствором 11 дОН, содержащим дС 1, с помощью концентрированной НС 1 устанавливают рН 3,0; выпавшие белки фильтруют, раствор охлажддют, осаждают ингибитор ацетоном, осадок отфильтровывают, растворяют в дистиллированной воде, обессоливают на сефадексе 0-15.По предлагаемому способу, для выделения активных полипептидов, обладающих антипротеазными свойствами, и их дальнейшей очистки, ингибиторсодержашую фракцию выделяют обработкой фильтрата ацетоном, добавляя 5 объемов ацетона на 1 объем фильтрата, при температуре -5 - +5 С. Далее формируют осадок в течение 18-22 ч, который промывают в ацетоне и высушивают, Для дополнительного освобождения ат денатурированных и агрегировавших белков порошок растворяют в дистиллированной воде и фильтруют через цеолитовый фильтр. Выход активного вещества составляет 28 г на 1 кг исходного сырья.Доказательства правильности выбранных в предлагаемом способе параметров выделения активных полип ептидов приведены в табл, 7-9.Из табл.7-9 видно, что наибольший выход вещества происходит при обработке фильтрата экстракта ацетоном в соотношении 1:5 при температуре -5 - +5 С, формировании осадка в течение 18-22 ч.Таким образом, в способе-прототипе для получения ингибиторов протеаз на этапах выделения активного вещества и его очистки, используют сложный процесс сорбции, промывание до определенной оптической плотности, десорбцию из ионитд, устдновку рН в элюдте, Эти процессы требуют дорогостоящего оборудования, длительных временных з;прдт.Выделение активных полипептидов и ихочистка по предлагаемому способу значительно упрощает технологию получениявещества антипротеазного действия, Процессы обработки фильтрата экстракта ацетоном,с последующим формированием осадка,растворением и фильтрацией через цеолитполученного раствора не требует значительных материальных и временных затрат, атакже специального оборудования,Таким образом, технологический процессвыделения вещества антипротеазного действия по способу-прототипу включает 18этапов, а именно:1) забор сырья;2) гомогенизация;3) экстракция;4) вакуум-дистилляция;5) охлаждение:6) отделение липидов сифонированием;7) фильтрация экстракта под давлением;8) сорбция на сульфокатионит при рН3,0;9) промывание сорбента;10) десорбция ингибитора протеаз раствором маОН;11) закисление среды до рН 3,0;12) фильтрация;13) охлаждение;14) осаждение целевого продукта ацетоном;15) фильтрация;16) растворение осадка;17) обессоливание раствора на сефадексе6-15;18) лиофилизация.Предлагаемый способ позволяет уменьшить число этапов, необходимое для получения вещества, обладающего антипротеазнымисвойствами, до 11 этапов, а именно:1) забор сырья;2) замораживание;3) гомогенизация;4) экстракция при встряхивании;5) декантация;6) фильтрация;7) осаждение целевого продукта ацетоном;8) промывание осадка ацетоном;9) растворение осадка;10) фильтрация через цеолит;11) лиофилизация.Таким оо разом, предлагаемый способсодержит 11 технологических этапов, вотличие от 18 этапов прототипа. Предлагаемый способ не требует применения дорогостоящих реактивов и ооорудования. Крометого, выход вещества, полученного позаявляемому способу, выше, чем выход вещества из такого же количества сырья по способу-прототипх, при примерно равнои активности целевого продукта.Способ получения вещества, обладающегоантипротеазным деиствием. иллюстрируется примерами.П р и м е р 1. Берут 1 кг свежеззмороженных околоушных слюнных желез крупного рогатого скота, измельчают на волчке. Сырье заливают 9 ооъемами раствора уксусной кислоты, содержащего 1 г хлористого цинка на 1 л смеси, доводя рН до 3.5. Экстрзкцию проводят в течение 48 ч при температуре +4 С, при постоянном встряхивании. По окончании экстракции надосадочную жидкость декзнтируют и фильтруют через бязевую ткань. К полученному фильтрзту добавляют ацетон в количестве 5 частей на одну часть фильтратз, при температуре 0 С, перемешивают, формируют осадок в течение 18 ч, Пол ченный осадокпромывают в ацетоне и высушивают, получают 70 грамм порошка. Порошок растворяют в дистиллированной воле из расчета 100 г порошка на 3 л дистиллированной воды, перемешивают в течение 1 ч, и, профильтровав через цеолитовый фильтр, лиофилизуют фильтрат. Выход активного вещества составляет 28 г из одного килограмма исходного сырья. Полученное вещество обладает антипротеазными свойствами,П р и м е р 2. Берут 2 кг свежезамороженных околоушных слюнных желез крупного рогатого скота и гомогенизуют на волчке. Гомогенат заливают 8 частями раствора уксусной кислоты, содержащего 1 г/л хлористого цинка, при рН смеси 3,0, Зкстракцию проводят в течение 36 ч при температуре +6 С, при постоянном встряхивании. По окончании экстрзкции надосадочную жидкость дека нтируют, и далее фильтруют через бязевую ткань. К полученному фильтрату дооавляют ацетон в соотношении 5 частей ацетона нз одну часть фильтрата, при температуре -4 С, перемешивают, и формируют осадок в течение 20 ч, Полученный осадок промывают в ацетоне и высушивают, получают 136 грамм порошка, Порошок растворяют в дистиллированной воде из расчета 3 л дистиллированной воды на 100 г порошка, перемешивают в течение 1 ч, фильтруют через цеолитовый фильтр, лиофилизируют фильтрат. Выход активного вещества составляет 56 г из одного килограмма исходного сырья. Полученное всшество обладает антипротеазными свойствами.Ингибируюшее действие на протеззы вещества. в-деленного по предлагаемому спосооу, изучали по его действию нз1823184 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ активность ряда ферментов по отношению к субстрдту, В качестве субстратд были использованы фибриновые пластины, Активность ингибиторд оценивали по уменьшению плошади лизисд субстратд под действием фермента. В контрольные пробы вместо исследуемого вещества вводился физиологический раствор.При изучении влияния полученного полипептида активность трипсина угнетдлась на 15,6%, стрептокиназы - на 24,5% и фибринолизина на 67,5%.Таким образом, по предлагаемому спосооу получают вешество, обладающее выраженным ингибируюшим действием нд фиоринолиз и протеолиз. По сравнению с ранее известными спосоодми получения всшеств антипротедзного действия, предлагаемый способ прост, не требует использования Способ получения вещества, обладающего антипротедзным действием, из околоушных желез животных, включдющий измельчение исходного сырья, гомогениздцию, экстракцию с последующей фильтрацией и очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и увеличения выхода целевого продукта, экстракцию осуществляют раствором уксусной кислоты при соотношении сырье;кислота 1:8 - 1:10 с дорогостояших реактивов и оборудования, позволяет достигнуть повышения выхода целевого продукта. В качестве сырья предлагается использовать околоушные слюнные железы крупного рогатого скота, являющиеся в ндстояшее время в большинстве регионов отходом производства. Осуществление предлагаемого спосооа при снижении затрат на производство позволяет одновременно снизить и число технологических этапов, а также затраты времени. необходимого на производственный цикл.Вещество, обладающее анти протеазным действием. может найти применение в медицине в качестве средства, необходимого для лечения острого сидлоденита. острого и хронического пднкредтитд, ткдневых повреждений, протекающих с выраженной активацией ферментов добавлением хлористого цинка в количестве 1 г на 1 л смеси при рН 3,0 - 3,5, температуре +4 - 8 С в течение 36 - 60 ч, экстракт фильтруют, фильтрат обрабатывают дцетоном в соотношении 1:5 при температуре -5 - +5-С в течение 18 - 22 ч, полученный осадок, содержащий целевой продукт, растворяют в дистиллированной воде, фильтруют на цеолите и лиофилизируют.182318412Таблица 1Влияние температуры предварительного хранения сырья на выход ингибитора протеаз Таблица 2Влияние концентрации хлористого цинка на молекулярную массу вещества, получен ного предлагаем ым способом Таблица 3Влияние рН среды экстракции на выход вещества и его молекулярную массу14 1823184Таблица 4 Влияние соотношения ткань: кислота на выход вещества, обладающего антипротеаэными свойствамиТаблица 5 Влияние времени экстракции на выход вещества и его молекулярную массуТаблицаб Влияние температуры экстракции на выход и молекулярную массувещества, обладающего антипротеаэными свойствами1 ЗгЗ 1 З16Таблица 7 Влияние соотношения объема ацетона и объема и фильтрата экстракта на выход вещества антипротеаэного действияТаблица 8Влияние температуры ацетона при осаждении и формировании осадка на выход вещества, полученного по предлагаемому способуТаблица 9 Влияние времени формирования осадка на выход вещества из околоушной слюнной железы крупного рогатого скота