Способ получения факторов 1, 2, 3, 4, 5 тейхомицина и их солей

(5 САНИ ОБРЕТЕНИ П анц с по- аце- Поа 839259,(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФАКТОРОВ 1,2,3,4,5 ТЕЙХОМИЦИНА А И ИХ СОЛЕЙ(57) Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения антибиотиков - факторов 1,2,3,4,5 тейхомицина А. Цель изобретения -разработка способа разделения тейхомицина А на факторы 1,2,3,4,5 иполучение их солей, сущность способа сводится к тому, что тейхомицинА, полученный при культивированииАс 1 пор 1 апез йесйошусеСспз поч. ГосудАРствеиый кОмитет ссПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫ(72) Анджело Борги, Роза ПаКаролина Коронелли и Джованнсани (1 Т)(56) Патент. Бельгии 1 Фкл. С 12 11, 1976. С 12 Р 1/06 // (С 12 Р 1/06С 12 К 1:045) зр, АТСС 31121, растворяют, подвергают обратнофазной хроматографии наколонке, заполненной спланированнымсиликагелем. Элюцию проводят с помощью линейного градиента от 10 до 203ацетонитрила в 0,27-ом растворе аммонийформиата. Соединяют фракциисходного профиля, концентрируютмощью бутанола и осаждают смесьютона и диэтилового эфира (1:1),лучают 410 мг фактора 1 и 770 мгфактора 2 в чистом виде, Далее смесьфакторов 3 и 2 и факторов 4 и 5 пропускают через колонку, заполненнуюоктадецилсиланом, элюируют смесьюводного 0,27-го раствора формиата аммония и ацетонитрила в соотношении76:24, Фракции отбирают, обессоливают и осаждают аналогично получениюфактора 1 и 2. В результате получаютдополнительно 510 мг фактора 2, .атакже 520 мг фактора 3, 350 мг фактора 4 и 300 мгфактора 5. Полученныеантибиотики обладают активностью вотношении грамположительных микроорганизмов. 4 табл.Таблица 45 Время удерживания, мин Фактор тейхомицина А 22,6 233 25,8 26,4 3,5"Диокситолуол вн т енний эталон 8 84 1 13181Изобретение относится к биотехно-логии, в частности к производствуантибиотиков.Целью изобретения является создание способа получения новых антибиотиков - факторов 1,2,3,4,5 тейхомицина А и их солей.П р и м е р 1. 10 г тейхомицинаА, полученного путем культивирования штамма Аспор 1 апез е 1 сЬошусе Ое 3,сцз поч. зр. АТСС 31121, растворяютв 1 л 0,27.-ной смеси формиата аммония и ацетонитрила (9:1). ЗначениерН полученного раствора с помощью1 н, раствора гидроокиси натрия доводят до 7,5. Раствор пропускают через колонку, содержащую 500 г силанированного силикагеля 60 фирмы Мерк.Затем колонку злюируют с помощьюлинейного градиента 10-2 ОЕ ацетонит Орила в 0,2%-ном растворе формиатааммония при общем объеме 10 л.Фракции (около 20 мл) собираюти исследуют с помощью ВТХ (тонкослойная хроматография под высоким давлением); колонка: 5 мк 1 огЬахОВБ(фирмы Дюпон (Эц Роп); подвижнаяфаза: линейный градиент О-ныйраствор Б в А в течение 40 минраствор А: 25 мМ НаН РО 4/ацетонитрила ЗО(9:1), забуферованный до рН 6,0 посредством 0,1 н, БаОН; раствор Б;25 мМ Ма 1 РО,1/ацетонитрила (3:7),забуферованный до рН 6,0 посредством О, н, БаОН); скорость потока2 мл/мин; детектор: УФ-Фотометр при254 нм.В табл. 1 указаны времена удерживаниядля факторов 1, 2, 3 4и 5 тейхомицина А в показательном про- щцессе разделения с помощью БТХ суказанием в ней условий проведенияхроматографии,70 2Фракции со сходным профилем ВТХсобирают и органический растворительупаривают под пониженным давлением.Оставшиеся водные растворы пропускают через колонку, содержащую 10 гсиланированного силикагеля 60 фирмыМерк. Колонку затем промывают дистиллированной водой в целях удаления Формиата аммония и элюируют502-ным водным ацетонитрилом. Элюатконцентрируют до небольшого объемапутем добавления бутанола для облегчения упаривания воды и осаждаютего смесью ацетона и диэтилового эфира (1:1). Получают 410 мг Фактора1 и 770 мг Фактора 2 тейхомицина Ав чистом вице.Смесь Факторов 3 и 2 тейхомицинаА (1:1) подвергают дальнейшей очистке с помощью ВТХ на полупрепаративной колонке при следующих условиях: колонка: ИЬашап РагС 1 з 3.1 ОРЯМ 9 10/50 (содержащая октадецилсилан); подвижная Фаза: 0;2 Е-ный Формиат аммония в смеси Н О и ацетонитрила (76:24); скорость потока:4,5 мл/мин; детектор: УФ-фотометрпри 254 нм; загрузка: 20 мг,Очистку проверяют исследованиемкаждой фракции с помощью ВТХ,Фракции, содержащие чистый фактор2 и 3 тейхомицина А, собирают, обессоливают и осаждают, как описано.Выход;510 мг фактора 2 и 520 мгфактора 3,Фракции, содержащие факторы 4 и5 в соотношении 1:1 (около 500 мг),полученные из первой колонки, объединяют с другой смесью фракций, содержащей факторы 4 и 5 (около 490 мг)и полученной в результате проведениявторого параллельного процесса разделения путем полупрепаративной ВТХ,разделяют при условиях, описанныхдля очистки фактора 3 тейхомицинаА, с получением 350 мг фактора 4 и300 мг. Фактора 5.Фактор 1 тейхомицина А представляет собой белый аморфный порошок,окоторый при температуре около 220 Соначинает темнеть и при 255 С полностью разлагается, Химико-физическаяхарактеристика его следующая:а) легко растворим в воде при зна-чении рН вьше 7,0 или ниже 2,-а так"же в ДМФ, ДМСО и пропиленгликоле,малорастворим в метилцеллозольве иглицерине, слаборастворим в метанолеи этаноле и почти нерастворим в хпо.этилацетате, тетрахлорметане;б) имеет спектрУФ-поглощения соследующими максимумами поглощения:в 0,1 н. хлористоводородной кислоте278 нм (Е,=49,5), в Фосфатномбуфере при значении рН 7,4 Ъ,И,ф макс278 им (Е,=50, 0), в О, 1 н. гидроьсм ф ффокиси натрия Ъ297 нм (Е=72,1);Ю4 смв) имеет спектр ИК-поглощения внуйоле со следующими максимумами поглощения: 3700-3100, 2960-2840 (нуйоль), 1645, 1590, 1510, 1460 (нуйоль), 1375 (нуйоль) 1305, 1230, 1180,151155, 1060, 1025, 970, 890, 845, 815,720 (нуйоль);г) элементарный анализ пробы,предварительно высушенной при темпебратуре около 140 С в инертной атмос- Л 1фере (% ды=8,5), показывает следующий приблизительный средний процентный состав,: С 56,70; Н 4,90,М 6,65, С 1 3,80, 0 (вычислен как остаток до 1007) 27,95; 25д) время удерживания (г ) составляет 21,2 мин в случае анализа путем обратнофазной ВТХ с использованием колонки 5 мк ЬогЬах ОПБ и элюированием с помощью линейного градиента, 0 - 507-ного раствора Б в растворе А в течение 40 мин со скоростью потока 2 мл/мин (внутреннийэталон: 3,5-диокситолуол при г8,84 .мин);е) в ДМСО-Й с добавлением не 356скольких капель Р 0 с концентрацией25 мг/0,5 мл ТМС в качестве внут реннего эталона: ос =0,00 ч. на млнполучают следующие группы сигналовв ЯМР-спектре 270 МГцН: 0,8-1,5(и),1,7-2,3 (м.); 2,7-4,0 (м.); 4,04,7 (м.); 4,8-5,8 (м,); 6,2-8,1 (м.);ж) имеет кислотную функцию, способную образовать соли;э) имеет солеобразующую основнуюфункцию;и) молекулярная масса, определенная масс-спектрометрией с использованием скорой атомной бомбардировки(САБ)в качестве источника ионов,составляет около 1875. Фактор 2 тейхомицина А представ 2 ляет собой белый аморфный порошок, который после нагреваний до 210 С начинает темнеть и разлагается полоностью при 250 С. Его характеристика следующая: 4а) легко растворим в воде при значении рН вьппе 7,0 или ниже 2, а такжев ДМФ, ДМСО и пропиленгликоле, малорастворим в метилцеллозольве и глицегрине, слабо растворим в метаноле иэтаноле и почти нерастворим в хлороформе, бензоле, п-гексане, ацетонитриле, диэтиловом эфире, ацетоне,этилацетате, тетрахлорметане,б) имеет спектр УФ-поглощения соследующими максимумами поглощения:в 0,1 н, хлористоводородной кислов фосфатном буфере при значениирН 7,4, 1 кс 278 нм (Е =49,0);в О,1 н, гидроокиси натрия "дмакс297 нм (Е 1 с =70,0);в) имеет спектр ИК-поглощения внуйоле со следующими максимумами поглощения: 3700-3100, 2960-2860 (нуйоль), 1645, 1590, 1510, 460 (нуйоль), 1375 (нуйоль), 1300, 260,1230, 1180, 1150, 1060, 1025, 9 О,890, 845, 815, 720 (нуйоль);г) элементарный анализ пробы,предварительно высушенной при температуре около 140 С в инертной атмосфере (% дую=9,8), показывает следующий приблизительный средний процентный состав, 7.: С 56,15; Н 5,15;Б 6,30; С 1 3,90, 0 (вычислен как остаток до 1007) 28,50;д) время удерживания (Г,к) в случае анализа путем обратнофазной ВТХс использованием колонки 5 мк ЬогЬах 008 и элюированием с помощьюлинейного градиента 0-50 Ж-ного раствора Б в растворе А в течение 40 минсоставляет 22,6 мин со скоростью потока 2 мл/мин (внутренний эталон:3,5-диокситолуол, гц 8,84 мин);е) в ДМСО-Й ь с добавлением несколькихкапель 00 с концентрацией25 мг/0,5 мл (ТМС в качестве внутреннего эталона: 3 =0,00 ч, на млнполучают следующие группы сигналовв ЯМР-спектре 270 МГц Н: 0,7-1,5(м)1,8-2,2 (м.); 2,7-4,5 (м.); 4,65,7 (м.); 6,2-8,1 (м.);ж) имеет кислотную Функцию, способную образовывать соли;з) имеет солеобразующую основнуюфункцию;и) молекулярная масса, определенная масс-спектрометрией САБ, составляет около 1877,Фактор 3 тейхомицина А представ 2ляет собой белый аморфный порошок,который после нагревания до 205 Сначинает разлагаться с полным разлоожением при 250 С. Он имеет следующуюхарактеристику:а) легко растворим в воде призначении РН выше 7,0 или ниже 2, атакже в ДМФ, ДМСО и пропиленгликоле,малорастворим в метилцеллозольве иглицерине, слабо растворим в метаноле и этаноле, и почти нерастворим вхлоройорме, бензоле, п-гексане, аце Отонитриле, диэтиловом эфире, ацетоне, этилацетате, тетрахлорметане,б) имеет спектр Уй-поглощения соследующими максимумами поглощения:в 0,1 н, хлористоводородной кислоте Ъ278 нм (Е =49,2), вфосфатном буйере при значении РН 7,4,Ъм, 278 нм (Е=50,8), в 0,1 н.гидроокиси натрия %макс 29" нм (Е=72,7); 20в) имеет спектр ИК-поглощения внуйоле со следующими максимумами поглощения: 3700-3100, 2960-2850 (нуйоль), 1645, 1590, 1510, 1460 (нуйоль), 1375 (нуйоль), 1300,.1230, 251180, 1150, 1120, 1060, 1030, 970,890, 845, 820, 800, 720 (нуйоль);г) элементарный анализ пробы, предварительно высушенной при температуре около 140 С в инертной атмосйере 30(% ам=12,0), показывает следующийприблизительный средний процентныйсостав, %; С 56,26; Н 5,20; М 6,69;С 1 3,95, О (вычислен как остаток до100%) 2,90;д) время удерживания (г ) - в случае анализа путем обратнофазной ВТХс использованием колонки 5 мк ЬогЪахОЭБ и элюированием с помощью линейного градиента О - 50%-ного раст 40вора Б в растворе А в течение 40 минсоставляет 23,3 мин со скоростью потока 2 мл/мин (внутренний эталон:3,5-диокситолуол при8,84 мин);е) в ДМСО-с 6 с добавлением нескольких капель П О с концентрацией25 мг/0,5 мл (ТМС в качестве внутреннего эталона 3 =0,00 ч, на млн)получают следующие группы сигналовв ЯМР-спектре 270 МГц Н: 0,7-1,5(м.); 1,8-2,0 (м,); 2,7-4,5(м.);,4,6-5,7 (м.); 6,2-8,0 (м.);1ж) имеет кислотную функцию, способную образовывать соли;з) имеет солеобразующую основную 55функцию;и) молекулярная масса определенная масс-спектрометрией САБ, составляет около 1877,Фактор 4 тейхомицина А представляет собой белый аморфный порошок,который после нагревания до темпеоратуры около 210 С начинает темнетьои разлагается полностью при 250 С,Он имеет следующую характеристику:а) легко растворим в воде при значении РН выше 7,0 или ниже 2, а также в ДМФ, ДМСО и пропиленгликоле,малорастворим в метилцеллозольве иглицерине, слабо растворим в метаноле и этаноле и почтй нерастворим вхлоройорме, бензоле, п-гексане, ацетонитриле,диэтиловом эфире, ацетоне,этилацетате, тетрахлорметане;б) имеет спектр УФ-поглощения соследующими максимумами поглощения:в 0,1 н, хлористоводородной кислоте макс 278 нм (Е=52,5),в фосйатном буфере при значенииРН 7,4 Я 278 нм (Е=52,5),в 0,1 н, гидроокиси натрия %а297 нм (Е;ю -75,5)в) имеет спектр ИК-поглощения внуйоле со следующими максимумами поглощения: 3700-3100, 2960-2840 (нуйоль); 1645, 1590, 1510, 1460 (нуйоль), 1375 (нуйоль), 1300, 1230,.1175, 1140, 1060, 1025, 970, 890,840, 85, 720 (нуйоль)",г) элементарный анализ пробы,Предварительно высушенной при темпеоратуре около 140 С в инертной атмосфеРе (% ьът=9,8), показывает следующий приблизительный средний процентный состав, %: С 56,50; Н 5,10;М 6,50; С 1 3,80; О (вычислен как остаток до 100%) 28,10;д) время удерживания (г ) в случае анализа путем обратнойазной ВТХс использованием колонки 5 мк ЬогЪах ОВЯ и элюирования с помощью линейного градиента О - 50%-ного раствора Б в растворе А в течение 40 минсоставляет 25,8 мин со скоростью потока 2 мл/мин (внутренний эталон:35-диокси-толуол, г 8,84 мин);е) имеет кислотную функцию, способную к солеобразованию;ж) имеет солеобразующую основнуюфункцию;з) молекулярная масса, определенная масс-спектрометрией САБ, составляет около 1891,Фактор 5 тейхомицина А представляет собой белый аморфный порошок,.о который после нагревания до 210 С начинает темнеть и полностью разлага 13181ется при 250 С. Он имеет следующуюхарактеристику:а) легко растворим в воде призначении рН выше 7,0 или ниже 2, атакже в ДМФ, ДМСО и пропиленгликоле, малорастворим в метилцеллозольвеи глицерине, слаборастворим в метаноле и этаноле и почти нерастворим вхлороформе, бензоле, п-гексане, ацетонитриле, диэтиловом эфире, ацето Оне, этилацетате и тетрахлорметане;б) имеет спектр УФ-поглощения соследующими максимумами поглощения:в 0,1 н. хлористоворородной кислоте %макс 278 нм (Е 1=49,6), 15в фосфатном буфере при значениирН 7,4 % с 278 нм (Е=51,8),в 01 н. гидроокиси натрия макс297 нм (Е,=78,8);в) имеет спектр ИК-поглощения в 20нуйоле со следующими максимумами по.глощения: 3700-3100, 2960-2840 (нуйоль), 1645, 1590, 1510, 1460 (нуйоль), 1375 (нуйоль), 1300 у 1230 р1175, 1145, 1060, 1025, 970, 890, 25840, 815, 720 (нуйоль);г) элементарный анализ пробы,предварительно высушенной при темпеьратуре около 140 С в инертной атмосфере (Х уа=10,1), показывает следующий приблизительный средний процентный состав, Х: С 56,60, Н 5,05,М 6,63, С 1 3,85, 0 (вычислен как остаток до 1007) 27,87;д) время удерживания (С) в случае анализа путем обратнофазной ВТХс использованием колонки 5 мк ЬогЪахО ОПБ и элюирования с помощью ли-.нейного градиента 0-503-ного раствора Б в растворе А в течение 40 минсоставляет 26,4 мин со скоростьюпотока 2 мл/мин (внутренний эталон:3,5-диокситолуол при г8,84 мин);е) имеет кислотную функцию, способную образовывать соли;ж) имеет солеобразующую основнуюфункцию;з) молекулярная масса, определенная масс-спектрометрией САБ, составляет около 1891.Каждый из факторов 1-5 тейхомицина А содержит кислотный остаток,способный образовывать соли,П р и м е р 2. Выделение факторов 1-5 тейхомицина А с применением хроматографической колонки из диэтиламиноэтилсефацеля.500 мл РЕАЕ-БерЬасе 1 (Рагшаса Гдпе СЪепаса 1 з, Швеция) вливают в 70 8колонку диаметром 4 см и затем уравновешивают с применением 50 ммоль аммонийхлоридного буфера при рН 9,0. На этой колонке хроматографируют 1 г комплекса тейхомицина А , растворенного в 50 мл того же буфера, элюируя элюирующей смесью, состоящей из того же буфера, с линейным градиентом 0-1 моль хлористого натрия в общем количестве 5 л, Затем собирают около 20 мл фракций, обрабатывают жидкостной хроматографией под высоким давлением, отдельные фракции, содержащие антибиотики, соединяют и обрабатывают в целях выделения веществ - антибиотиков.Ниже приведены наивысшие концентрации отдельных факторов, мп. элюированного объема:Тейхомициновый Наивысшая концентФактор рация, мл28003300350038004000П р и м е р 3. Получение солей факторов 1-5.1К солям со щелочными и щелочно- земельными металлами относятся соли натрия, калия, лития, кальция и магнияАммониевые соли включают аммониевые соли и соли первичного, вторичного или третичного алкиламмония С,и оксиалкиламмония ССоли со щелочными и щелочноземельными металлами получают известными способами. Так, Факторы тейхомицина А в свободном кислотном виде раст 1воряют в пропиленгликоле с последующим постепенным добавлением к полученному раствору стехиометрического количества выбранного минерального основания, осаждением и фильтрацией.Указанные соли можно также получить практически в безводном виде посредством лиофилизации. В этом случае водные растворы соли, полученныев результате образования солей из свободных кислот с помощью карбонатов или гидроокисей щелочных или щелочноземельных металлов в количествах, обеспечивающих значение рН в5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 9 131пределах 7-8, отфильтровывают от нерастворимых веществ и лиофилизуют,Органические аммониевые соли получают добавлением амина к растворуфакторов 1-5 тейхомицина Аг в свободном кислотном виде, например, в пропиленгликоле с последующим упариванием растворителя и избыточногоаминного реагента или взаимодействием двух реагентов в минимальном количестве воды с последующим осаждетнием полученных солей путем добавления нерастворителя.,Факторы 1-5 тейхомицина А содергжат также гидроксидный остаток, засчет которого также могут быть образованы соли путем взаимодействияотдельных факторов В чистом виде ссильной кислотой, предпочтительноминеральной.П р и м е р 4. 0,5 г фактора 1,2,3,4 или 5 тейхомицина А в видесвободной кислоты растворяют в воде(около 50 мл), рН 7,5. Доводят раствор до рН 6,5 1 О -ной хлористоводородной кислотой и прибавляют стехиометрическое количество ЕпБО 7 НгО(или СиБО 45 Е О), растворенное в минимальном количестве воды,Смесь перемешивают при комнатнойтемпературе для облегчения образования осадков, которые собирают фильтрованием, дважды промывают ацетоном(около 600 мл) и сушат всю ночь в вакууме при комнатной температуре,Получают 0,43 г (85-88/) цинковой или медной соли фактора 1,2,3,4или 5 тейхомицина Аг.И р и м е р 5. 0,5 г фактора 1,2,3,4.или 5 тейхомицина А в видесвободной кислоты растворяют в минимальном количестве ацетонитрила, Прибавляют воду (около 50 мл), рН 7,5.Доводят раствор примерно до рН 6,510 .-ной хлористоводородной кислотой.Прибавляют стехиометрическое количество ВаС 1 (или СаС 1 или М 8 С 1 г),растворенное в минимальном количестве воды.1Смесь перемешивают при комнатнойтемпературе, Полученную соль удаляютприбавлением избытка ацетона (около500 мл) и фильтрованием полученныхосадков, которые дважды промываютацетоном (около 600 ип) и подвергаютпродолжающейся всь ночь сушке в вакууме при комнатной температуре.Получают 0,40 г (84-.87 ) бариевой(кальциевой или магниевой) соли,8170 10 П р и м е р б, 0,5 г фактора 1,2,3,4 или 5 тейхомицина Аг в виде сво 1бодной кислоты растворяют в минимальном количестве ацетонитрила. Потомприбавляют воду (около 50 мл), рН7,5, Доводят раствор примерно до рН6,5 10 -ной хлористоводородной кислотой. Прибавляют стехиометрическоеколичество основания (в виде концентрированного водного раствора дляКОН или ИНОН или в виде чистоготвора в луч ХН СН ИН СННН(СН,) 11 Н(С) 11(СЙ,)И(Сг,) и т.д.)Смесь перемешивают при комнатнойтемпературе. Полученную соль удаляютприбавлением избытка ацетона (около500 мл) и фильтрованием полученныхосадков, которые дважды промываютацетоном (около 600 мл) и сушат втечение ночи в вакууме при комнатнойтемпературе.Получают 0,45 г (84-90 ) соответ-ствующей соли.П р и м е р 7Получение натриевой соли фактора 2 тейхомицина А,Водный раствор фактора 2 тейхомицина А (150 мг, 15 мл) путем добавления по каплям 0,1 н. раствора ИаОН доводят до рН 80, Полученный раствор фильтруют и переносят в камеру системы сублимационной сушки и замораживают, По завершении замораживания камеру эвакуируют до давления 0,1 Торр и лед сублимируют доведением нагревательной плиты до 0 С, продолжая этот процесс до достижения почти сухого состояния продукта (до влагосодержания около 1 Ж). Титрование раствора полученной таким образом натриевой соли фактора 2 тейхоиицина А в 25 мл метилцеллозольва/ Н О (3:1) с 0,1 н, раствором НС 1 показывает присутствие двух титруемых функций, отличающихся следующими значениями рН: 7,03 и 4,78.По указанной методике получают соответствующие натриевые соли факторов 1, 3, 4 и 5 тейхомицина Аг . Определение количества натрия в конечных солях подтверждает образование мононатриевой соли.Бактериостатическую активность факторов 1-5 тейхомицина А п чСгог против грамположительных бактерий определяют на клинических иэолятах бактерий Бйар 1 ту 1 ососспэ и Бтгерйососсцэ с использованием метода двукратного разведения с помощью микроФактор тейхомицина АМикроор Гаиизм 3 4 5 та 0,2-0,0,8-1,6 0,1-1,6 О, 2-0,80,2-0,850006 0050,05"0,1 0,4-0,8 0,2"0,8,8-1,6 4 0,2-1,6 0,006-0,0005"01 0025-Ов 0,05-0,1 05-0,1 0,025 ВГгеРГососсцзв РУо 8 епез Зсгерсососсцвв рпецшоп 1 0,05-0,1 в 0 01-02 01-04 Зсгергососсцвв Еаеса 11 вЗггергососсцзвв 1 г 1 в 5 02-04 01-Ов1 0,025 0,025 0,1-0,40,025,4 Зсге0,1 0,1 О,агаровых пла пензией испь Пластинки ин чение 8 ч и стинок, засеянных туемого микроорга кубируют при 37 С измеряют диаметры Я е изма, в те- зон ингибированиНиже привния:Фактор теи12 мицина А 841 О/мг 1086 О/мг 1131 О/мг 1066 О/мг 954 О/мг45 50 1381 титровальной системы, причем для названных групп бактерий используют .бульоны Пенассея и Тодда-Хьювитта фирмы Дифко. Выращенные в течение ночи бульонные культуры разбавляют до содержания 10 млн кл ./мл. Минимальной бактериостатической конценБактериостатическое действие 1 п ч 1 гго ЗгарЬу 1 ососсцв в ацгецзВгарЬу 1 ососсцв, ер 1 оепвЫ 1 Бактериостатическую активность отдельных факторов 1-5 определяют ме тодом повторного разведения с помощью агаровых пластинок с использованием бактерий штамма 8. апгепз АТСС 6538 в качестве испытуемого микроба и смеси тейхомицина А в качестве эталона. При этом одинаковые количества отдельных факторов 1-5 тейхомицина А и смеси последнего в качестве эталона растворяют в ДМФ при концентрации 2000 мкг/мл. Полученные растворы подвергают дальнейшему разведению с использованием 0,067 моль фосфатного буфера для установления рН 7,4 и добавлением 17.-ной бычьей сыворотки в целях обес печения следующих концентраций: 2,5; 5, 10 и 20 мкг/мл. Диски фильтровальной бумаги пропитывают растворами пробы и помещают на определенных расстояниях на поверхность 70 12трацией считается самая низкая концентрация, при которой отсутствуетвидимый рост после инкубации в течение 18-24 ч при 37 С,Полученные результаты приведеныв табл. 2,Таблица 2факторов 1-5 тейкомицииа А едены результаты испыта Смесь теихомицина А 1000 О/мг Действие факторов 2, 3, 4 и 5 тейхомицина А испытывали в эксперименте с мьппами, зараженными 8. рпеошоп 1 ае и Я. руорепез. Для сравнения брали смесь тейхомицина Аг,Полученные результаты указанных опытов приведены в табл. 3.13 131810 14 Та блица 3Бактериостатическое действие на мьшах ЭД д (м 1 кг/сут) и к фактортейхомицина А Я, рпещпоп 1 ае Е 4 Б. руоеепез Ьэ 2 0,28(0,22-0,34) 0,15(0,13-,0,18) 0,27(0,23-0,32) 0,13(0,11-0,16) 3 4 О, 12 (0,98-0, 14) 0,098(0,073-0,11)5 О, 13 (О, 10-0, 15) О, 1 О (О, 098-0, 13) Смесьтейхомицина А 0,35(0,28-. 0,44) 0,18(-) Примерная ЛДомг/кг Фактор тейхомицина А 1500 2000 )1500 с 2000 1000 1500 500 с 1000 )500 -1000 Приблизительная острая токсичность на мышах (внутрибрюшинно) для факторов 1-5 тейхомицина А приведет на в табл. 4,Таблица 4 Острая токсичность на мышах (внутрибрюшинно) 1Из табл, 4 следует, что факторы 1-5 тейхомицина А пригодны для применения в качестве действующего начала в противомикробных препаратах в медицине и ветеринарии для предупреждения и лечения инфекционных заболеваний, вызванных патогенными бактериями, чувствительными к названным соединениям. Предлагаемые соединения можно использовать для лечения инфекционных заболеваний как таковые, т.е. как отдельные факторы или ввиду сходства их характеристик активности и в виде смеси двух или более факторов в любом соотношении.Соединения вводят орально, местно или парентерально, предпочтитель" но парентерально. В зависимости от способа применения соединения его готовят в различных лекарственныхформах, Для орального введения препараты могут представлять собой кап сулы, таблетки, жидкие растворы илисуспензии. Как известно, капсулы итаблетки кроме действующего началамогут содержать еще обычные инертныенаполнители (носители), такие как 30 разбавители, например лактоза, фосфат кальция, сорбит и др., смазки,например стеарат магния, тальк, полиэтиленгликоль, связующие, например поливинилпирролидон, желатин,сорбит, трагант, камедь, ароматизирующие вещества, средства, способствующие разложению препарата и смачиватели, Жидкие препараты обычнов виде водных или масляных растворов 40 или суспензий могут содержать, обычныедобавки, например вещества, содействующие взвешиванию, Для местного применения соединения можно приготовить в ниде препаратов для введения 45 через слизистые оболочки носа и горла или бронхиапьные ткани, обычно ввиде жидких аэрозолей или средств дляингаляции, лепешек или тинктур, наносимых на поверхность горла. Для лечения глаз или ушей можно использоватьжидкие или полужидкие препараты, Препараты для местного применения можно приготовит:ь на гидрофобной илигидрофильной основе в виде мазей, 55 кремов, лосьонов, тинктур или порошков, впрыскиваемые составы - в видесуспензий, растворов или эмульсий наоснове масляных или водных носителей,содержащих вещества, способствующиеформула изобретения Составитель Г,СмирноваРедактор К.Волощук Техред М.Моргентал Корректор И.Муска Заказ 2441/58 Тираж 499 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 15 13 взвешиванию, стабилизаторы и/или диспергаторы. Кроме того, действующее ,начало может быть приготовлено в виде порошка в целях его воспроизводства во время поставки с пригодным носителем, например, стерильной водой.Количество применяемого действующего начала зависит от различных факторов, например роста и состояния здоровья пациента (животного), способа и частоты применения препарата и причины заболевания. Как правило, факторы 1-5 тейхомицина А являются2 эффективными при суточной дозировке в пределах около 0,1-20 мг действующего начала на кг веса, причем эта доза может быть разделена на два приема в день. Целесообразны составы, приготовленные в виде дозировочных единиц с содержанием около 50- 250 мг действующего начала на единицуПримеры фармацевтических составов: раствор для парентерального введения из 100 мг натриевой соли фактора 2 тейхомицина А, растворенной в 2 мл стерильной воды для впрыскивания; раствор для парентерального введения из 250 мг натриевой соли фактора 3 тейхомицина А, растворенной в 3 мп стерильной воды дпя впрыскивания; мазь для местного нанесения из 200 мг фактора 2 тейхомицина А 600 мг полиэтиленгликоля 4000 Б.Я.Р., 1,2 г полиэтиленгликоля 400 Б.Б.Р.Наряду с применением в виде лекарств предлагаемые соединения можно испольэовать и как промоторы роста животных. С этой цели одно или несколько соединений вводят орально 18170 16с кормом. При этом выбирается такаяконцентрация соединений, которая является эффективной для промотирования роста животных. При этом сначалаготовят смесь части корма с эффективным количеством действующих соединений, которую затем добавляют к полной порции корма, или с кормом смешивают промежуточный концентрат, со держащий деиствующее начало,1. Способ получения факторов 1,2,15 3,4,5 тейхомицина А и их солей, заключаЮщийся в том, что тейхомицин,полученный путем культивированияштамма Асопор 1 апез ТехсЬошусей 1 сиепоч. зр. АТСС 31121, переводят в ра 20 створ, подвергают его обратнофазнойхроматографии на колонке, содержащей силанированный силикагель, элюируют с помощью линейного градиентаот 10 до 207. ацетонитрила в 0,2 Х-ном25 растворе аммонийформиата, полученныефракции сходного профиля объединяют,концентрируют осаждают целевые продукты и/или переводят в соли,30 2Способ по п. 1, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью дополнительного разделения факторов 2, 3, 4, 5 тейхомицина А, смесь факторов 2, 3, 4 и 5 подвергают обратнофазной хроматографии на колонке, содержащей октадецилсилан, элюируют смесью ацетонитрила и 0,2 Е-ного водного аммонийформиата в соотношении 24:76 с последующим обессоливанием фракций 40 и осаждением целевых продуктов.