Способ получения биомассы

Государстовнньй комитет ССОР ао долам изоорвтвний и открытий(088.8) Дата опубликования описания 05,12.79(72) Автор изобретения ИностранецДональд Оливер Хитцмэн(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ Изобретение относится к технике получениябелка из одноклеточных микроорганизмов путем выращивания последних на углеродсодержащих субстратах.Известен способ получения биомассы, предусматривающий выращивание микроорганизмовв условиях аэрации на питательной среде, со.держащей окислеиные углеводороды в качествеисточника углерода, источник азота и необходи.мые минеральные соли 11.Подобное сырье легкодоступно, его получаютиз нефтяных источников природного газа, различных процессов обработки сточных вод и отходов и превращений метана, и фермеитацииразного рода злаковых, сухой перегонки древе.сины н т. п.Окисленные углеводороды являются сравнительно дешевым сырьем для ферментативныхпроцессов, причем это сырье частично окиспено,так чта в процессе выращивания и конверсиисокращается потребность в молекулярном кис.лоро де,Однако при промышленном осуществлениипроцесса получения биомассы из одноклеточныхмикроорганизмов его необходимо проводить Союз Советских ) вСоциалистическимиРеспублик при относительно умеренной температуре 2050 С, предпочтительно не выше 35 С. Микро.биологическая конверсия является высоко зкзотермической реакцией. окисления с высокимвыделением тепла, которое должно отводить.ся непрерывно и последователыю для исключения перегрева системы и гибели микроорга.низмов, Кроме того, повышение температурысоздает опасность ограничения роста микроорганизмов и воэможность снижения в результа.те этого эффективности процесса,Целью изобретения является интенсификацияпроцесса.Это достигается тем, что в предлагаемомспособе получения биомассы выращивание осуществляют при 45 - 65 С, при этом в качествемикроорганизмов используют бактерии родаВас 1 из штаммы Хф ВАЯЯ. В - 8065 или1 чЯЯ В - 8066.3) Кроме того, в питательную среду вводятсоль марганца,Способ осуществляют следующим образом.Микроорганизмы в виде бактерий рода Ва.с 11 цз штаммы ВАЯЯ. В - 8065 или 1 чЯЯ 1. В.И выращивают в условиях аэрации на питатель.ной среде, содержащей окисленные углеводоро.ды в качестве источника углерода, источникаэота и необходимые минеральные соли при45-65 С, предпочтительно при 50-60 С.Концентрацию субстрата в ферментере под.держивают на уровне 0,01 - 5 объем/об,% дляисключения торможения роста бактерий.Кислород подают в культуральную среду влюбом виде, способном легко ассимилироваться внесенными микроорганизмами. Можно ис- Опользовать молекулярньй кислород, которыйсодержится в воздухе, например, при атмосферном или повышенном давлении, или в воздухеобогащенном кислородом, или из другого доступного источника в зависимости от условий 15проведения процесса.Воздух с нормальным содержанием кислорода подают в количестве 0,1 - 10, предпочтительно 0,7 - 2,5 объем/мин на объем жидкости 6ферменте или в пересчете на кислород, соответ. 20ственно 0,02-2,1 и 0,14-0,55,Давление в процессе микробиологическойконверсии поддерживают от 0,1 до 100 ат,предпочтительно от 1 до 30 ат, а еще предпоч.тительнее немного вьпде атмосферного, учитывая растворимость кислорода,Использование давления немного выше атмосферного способствует повышению концентрациикислорода, растворенного в водной культуральной среде, что в свою очередь способствует по- ЗВвышению скорости роста клеток.В качестве окисленных углеводородов исполь.зуют спирты, кетоны, сложные и простые эфиры, кислоты и альдегиды, по существу водорастворимые, но содержащие до 10 углеродных ато 35мов в молекуле.Из окисленных углеводородов используютследующие соединения: метанол, этанол, про.панол,бутанол,пентанол,гексанол,гептандиол,7;гептанол; 2-метилпентанол; пептано 40ф,/ .1вая кислота; 2-метилбутановая кислота; пентанол; 2-метилбутанол,2-метилбутанол.3;бутанол;2-метилпропанол,2-метилпропанол,пройнол; муравьиная, уксусная, пропановая кислоты; формальдегид; ацетальдегид; про 45паналь; бутаналь; 2-метил-пропанапь, бутановая кислота; 2-метилпропионовая кислота; пентановая кислота; глутаровая кислота; гексановаякислота; 2-метилпентановая кислота; гептадио.новая кислота; гептановая кислота; гептанон;гептанон; октановая кислота; 2-этил.гексановая кислота; глицерин; этиленгликоль, пропи.ленгликоль; метил-этиловый эфир; диметиловый эфир; ди-н.пропиловый эфир; пропанон;бутанон; диэтиловый эфир; н.пропилизопропиловьд эфир, включая смеси двух или болееиз них, а также материал под названием "ме.ивовое топливо", представляющий собой смесь метанола и регулируемого количества высшихспиртов, содержащих до 4 атомов углерода вМолекуле.Источником азота может служить азотосо.держащее соединение в виде, пригодном дляметаболического использования микроорганиз.мами. Используюттакже различные источникиорганического азота, например, белки, мочеви.ну и т. п., но практически используют неорга.нические источники азота, например аммиак,едкий аммоний, различные соли аммония, вчастности цитрат, фосфат, сульфат и пирофосфан аммония.Удобен для использования газообразный аммиак путем барботирования через воднуюкультуральную среду,рН культуральной=среды поддерживают от 5до 9, предпочтительно от 6 до 8, при этомбактерии рода ВасШца штаммы МЯЯ. В - 8065или 1 ЧЯЯ 1. В - 8066 предпочитают для роста соответственно рН от 6,2 - 6,8 и от 6,2 до 6,5причем в среде УМ 2,Кроме источников углерода, азота, кислорода в культуральную среду вводят необходимыеминеральные соли для обеспечения роста мик.роорганизмов и доведения до максимальной ас.симиляции окисленного углеводорода клеткамив процессе микробиологической конверсии.Из минеральных солей используют ионы фоьфора, магния, кальция, натрия, марганца, молибпена и меди.Состав среды (УМ 2 - тверды), г: монокалийфосфат 2,0; дикалийфосфат 3,0; сернистый магний семиводный 0,4; хлористьй кальций двухаодньй 0,04; хлористьй натрий 0,1; сульфатаммония 2,0; агар 15,0; дистиллированная вода 1000 мл,Добавляют также раствор следовых минералов,г;сульфат меди 0,06; иодистый калий 0,08;гидрат сульфата марганца 0,3; молибдатнатрия двухводньй (йазМоО 2 НзО) 0,2;юрная кислота 0,02; сульфат цинка семиводньй 2,0; хлорное железо шестиводное 4,8;дистиллированная вода 1000 и серная кислота(конц) 3 мл, Перед употреблением вносят всреду стерильньй метанол до 1,5 об.%.В случае жидкой среды агар не вносятДругие материалы, например дрожжевой.экстракт, витамины, биотин и г, п., или, другие факторы роста добавляют в количествах,известньи, в области ферментации,Бактерии рода ВасИ 1 ца штаммы ййй. В -8065 и йЯЯ 1. В - 806 б хранят в коллекцииСША под номерами 47 и 72 соответственно(департамент сельского хозяйства, служба."сельхозисследования, Исследовательская лаборатория Северных районов, Пеория, Иллинойс,61604) .0,2 О,1 7015Эти штаммы являются высоколродукпзвцыми при относительно высокой температуре ферм ентации.Культура Р 47 )ЧВВ). Вграмполажительная, спорообразующий микроб формы толстой 5 палочки, окрашенного пигмента не имеет. Культура У 72 МЙВ) В - 806 б грамполокительйая, спорообразуюший микроб формы толстойпалочки, окрашенного пигмента не имеет.1 ОХарактеристика и свойства используемыхбактерий в сравнении со свойствами известныхкультур рода Вас 11)иа приведены в табл. 1.В случае промышленного продуцированиябольших количеств микробных клеток процесс 15выращивания проводят непрерывно, и все оборудование, включая реактор или ферментеры,контейнеры, трубопроводы, охлаждазощие илициркуляционные приспособления, стерилизуютс помощью пара при 121 С, например, 15 мин. 20Простерилизованный реактор инокулируют культурой микроорганизма в присутствии всех необходимых питательных веществ,С началом роста культуры непрерывно подают раздельно воздух, питательную среду, источ.25ник азота и окисленный углеводород, Скоростьподачи потоков ингредиентов может колебаться для поддержания возможно быстрого ростаклеток при эффективном использовании подаваемого окисленного углеводорода и при обес 30печении высокого выхода веса клеток на весзагруженногоисточника углерода,Скорость подачи источника углерода регули.руют так, что подаваемое в ферментер количество равно количеству, потребляемому мик 35роорганизмами для исключения пересышенности в частности токсическими материалами, например спиртом или альдегидом,которые могуттормозить рост или приводят к гибели микро.40организмов.Сырье стерилизуют до момента его подачив ферментер.В случае, если окисленньй углеводород, на.пример метанол, этанол или формальдегид, имеет способность стерилизовать прочие материалы,45то целесообразно добавлять этот компонент впрочие потоки, например в минеральную средупри этом последнюю в этом случае уже неподвергают отдельной стерилизации при помо 50щи тепла и т. п.Выращивание микроорганизмов ведут в фер.ментере известного типа, предпочтительно за.полненном пеной, которая образуется при используемой температуре ферментации и обес 55печивает высокую степень роста. В этом случаенеобходимо следить за скоростью роста во избежание выброса пены из ферментера, что можетпривести к уменьшению в нем объема жидкос 45ти и пате)зе.одержззлзого. 1111 д сдз б;1 зу 11 акже высокому содержаинзо в цзел 1 рдсп:;о.ренцого кислорода и павьциеццому его перцо.су, необходимому для цо,перз 1;д.И 1 н 1 исксйплотцосп 1 клеток и бысгрол.у раду . ик; оо д.низмов,Как. кззеточцый, так и 1 знсклеза снях, 11 ролу.;тизвлека от известцылн 1 спообд 1 и.Клетки выдеззяюг цз зф.11 нецд феклцу р;путем фугавация, ф 11;гыраци 11 и г, ц. 31,злзос:11.освобаждеццьй от клеток, лзажз.:дтсл 1 об)ч;.ботать ацетоном или иизк:1 м сп 11 рз и. 11 д 111.;1 мер этацолам илц метанолом,. для осажденияПОЛУЧЕШЮГО ВНЕКЛСтачназО ПО. И 1 1)изата Лзаз.риала. Эфлзоецг можно также об)здаотдзь методам сольвецтцой экст 1 здкцзи 1 и,1111 И зк 1 дкцнчщелочью )тля извлечения других ззцезслегоч 11 ьзхпродуктов, например 11 игмсцтол, взпал 1111 нчз цлцоргин 1 чсских кислот 11 оцу и, зн 11,1 х Р и Г 01;,. 1 свырашив а ип я.При м е р 1. з)ро;,сдяг цецрсзь;е:1 ьзг 11).,зцесс ферментациц, для чего беруз 500 лл 1111 с.КУЛУМа ВОЛНОЙ ЧИСПЕРСЦИ Кяеза; К 1.1 Гиз Л1) 72, КЯ 81. ВбС и 1 зь 11 зд 1 ц;.-;Нки " и, д1среде ВК - М с 1,5 аб,Ь метдцала, Сас:ан ср.дьз ВН - М, г/л; монокалийфосфдт 2,0; дцкалийфосфат 3,0; сульфат лсдгция се, 111,111 и,п; 1.1,.1хлористьй кальций двзхводцьнз 1.1 Ю: :и ф,ззаммозпзя 2,0 и 10 лзл/11 рдствазд лс.,01 ззн.:.ннералов,Раствор следовых мицердлол имеет сз 1 сцу:о.щий состав, г/л; сульфдт железа сслзцззодц дй0,11; сульфат цинка семиззодззый 1 з,ОЗ, гзи.фат меди зтяпзводзпзй 0,02, у:.1.,1 д 1 лзд)гаиид(гидрат) 0,02 и 1 мл/л коццезг)лзрочдццо 11серной кислоты.Указанный ицокулум вносят в ферлзсцтср,имеющий перемезшзвазошсе и а:зрз.)зунчцсс устройства, с 2 л среды (ца иоиа 111 оноццой ва.де) следующим образам.Состав среды ГМ 12Фосфорная кислота 85;. лзиХлористый калий, г 1,ОСульфат магния семиводцз:111, г 1,5Хлориотый кальций двухводный, гХлористый натрий, гРаствор следовых минералов,10,0Дистиллированная вода, л до 1Состав раствора следовых мицерзлов, г/л;сульфат меди пяпзводцьй 0,0 о; иадцтый кдлий 0,08; хлорное железо зпесгиводиое 4,80;сульфат марганца (гидрат) О.ЗО; молибд;п цат.рия двухводный 0,20; сульфат нинка селиводный 2,00; барная кислота 0,02; казшензрцро.ванная серная кислота 3 мл и шзиллировацная вода до 1 л.Первоначальное содержание метанола1,5 об,%/объем рН - 6,7, температура 55 С, ско.рость перемешивания содеожимого 1000 об/мин,воздух подают со скоростью 2 л/мин,Непрерывно подают едкий аммоний для поддержания 5рН в интервале 6,7 - 6,9, а также. используя егов качестве источника азота.Затем, после хорошего размножения инокутж.ма, подают непрерывно питательную среду с содержанием метанола 5% (объемы) и отводятсоответствующий объем эфлюента из ферментера,Скорость подачи питательной среды 150 -800 мл/час в течение 800 ч со средней про.должительностью удержания клеток в фермен 5тере от 2,4 до 5 ч.Из эфлюента через некоторое время отбира.ют пробы для извлечения клеток, которые сушат, взвенжвают и анализируют на белок.20Концентрация клеток составляет от 12 г/л(сух. вес) в начале опыта (24 ч) до 18 г/л че. рез 190 ч и до 24 г/л в конце опыта, Конвер-.сия метанола в извлекаемые клетки достигает44% (от исходного загружаемого).Таким образом, бактерии рода Вас оа штаммйЯВ. В - 8066 можно легко выращивать непрерывным способом при 55 С на метаноле в качестве источника углерода,Клетки этого вида содержат высокое про 30центное содержание белков.Пример 2. В другом типе ферментера непрерывного действия выращивают культуруМНВВ 8066 как описано в примере 1. Ферментер инокулируют 500 мл водной дисперсии35культуры, выращенйой в течение 26 ч на среде УМ 2 с 1,5 об.% метанола (состав среды описан вьште),Инокулум вносят в ферментер, как описанов примере 1. Ферментер содержит 2 л средыГМ - 12, описанной в примере 1 затем исключением, что в среду добавляют лишь 5 мл/лраствора следовых минералов.Первоначальное содержание метанола1,5 об.%/объем рН - 7,1 и температура 53 С.В течение первых двух часов перемешиванияи объем подаваемого воздуха медленно повышагот до 800 объем/мин и 2 л/мин соответственно,Для поддержания рН 7 - 7,2 и в качестве источника азота вводят едкий аммоний.После установления хорошего роста инокулу.ма в течение первых 24 ч подают непрерывнопитательную среду, содержащую 7,5 об.% метанола и 0,05 г/л гидрата сульфата марганца иотводят соответствующие эфлюенты из фермен.Скорость подачи питательной среды составляет 200 - 400 мл/час в течение 94 ч. Средняя про должительность удерживания в ферментере составляет 3 - 5 ч. Эфлюент из ферментера периодически проверяют взятием проб, извлекают клетки, сушат и взвешивают.Концентрация клеток после 24 ч составляет 17 - 26 г/л (сух. вес).Конверсия метанола в извлекаемые клетки составляет 43% от загруженного. П р н м е р 3, Проводят непрерывную ферментацию, используя культуру Р 47 НБВД В - 8065,В ферментер загружают 2 л среды ЕМ - 12,описанной в примере 2, но с использованиемобессоленной воды, Затем загружают 500 млводной дисперсии культуры И 47 ИВВ 1 В,выращенной в течение 11 ч на среде ЗМ 2 с1,5 об.% метанола.Первоначальное содежание метанола1,5 об.%/объем рН - 6,45, температура 54 С. Едкий аммоний вносят, как в примерах 1 и 2,для поддержания рН 6,3 - 6,6 и в качестве ис.точника азота. Перемешивание и подачу воздуха постепенно повышают до 400 об/мин и до0,5 л/мин соответственно в течение 7 ч. После11 ч непрерывно подают питательную средуРМ - 12, приготовленную на водопроводной воде с 2,5 об.% метанола и добавлением солейпо 1 г/л КНзР 04 и КзНР 04 каждой и неболь.шого. количества противопенного средства. Через 28 чфподачу изменяют, добавляя гидратсульфата марганца до увеличения его концентрации (в сырье) в два раза, для стимулирования потребления клетками кислорода.В течение 101,5 ч опыта вносят дополнительные количества . следовьтх минераЛов. Как установлено, они не оказывают стимулирующего действий на рост клеток.Кроме воздуха в ферментер после 24 ч работы подают кислород со скоростью от 0,12до 0,4 л/мин, За это время соответственно повышают скорость перемешивания от 400 до800 об/мин,Из эфлюента периодически отбирают пробыдля извлечения клеток, которые сушат и взве.шивают,Скорость подачи среды повышают от300 мл/час при 28 ч до 850 мл/час к 71 ч и1070 мл/ч к 95 ч. Продолжительность пребывания клеток колеблется от 1,8 до 2,5 ч в тече.ние последних 30 ч, Концентрация. клеток достигает 7 - 10 г/л (сухой вес), а конверсия метанола в извлекаемые клетки 50% от загру.женного.Таким образом, культура Х 47 МЯЛ. В - 8065дает достаточный выход микробных клетокпри выращивании на метаноле в качестве един.ственного источника углерода при относитель.но высокой температуре ферментации.10 101545 О 25 30 9При ме р 4. Содержание белка в клеткахновых видов Вас 1 ов 70 - 85 вес,%, причем этавеличина получена умножением весового процента азота (по Къельдалю) в сухих клеткахна коэффициент 6,25. При гидролизе высушен.ных клеток и анализе на аминокислоты ме.тодом газовой хроматографии устанавливают,что содержание белков находится в пределах55 - 70 вес.%,Распределения аминокислот в образце бактериальных клеток с использованием культуры У 72 ИВЯ 1. В - 8066 следующее.Незаменимые аминокислоты, г/100 г сухих15 клеток;лейцин 5,52; изолейцин 4,68; лизин 5,36;метионин 1;38;цистин 0,05; треонин 2,93; фенилаланин 2,72; тирозин 2,00; триптофан 0,79;валин 5,25,Заменимые аминокислоты, г/100 г сухих кле. ток: алании 5,83; аргинин 2,93; аспарагиновая20 кислота 6,38; глицин 3,76; глутаминовая кислота 9,95; гистидин 1,18; пролин 2,37; серии 1,96; всего - 65,04. Всего незаменимых аминокислот 30,68, при. чем содержание цистина и метионина сравнительно невелико.. При этом некоторые образцы клеток имеют 0,00 г цистина на 100 г сухих клеток, что может быть отрегулировано добавлением соответствующих количеств синтетического цистина или метионина в рацион,П р и м ер 5. Проводят контрольный опыт,в котором несколько культур термофильныхмикроорганизмов пз рода Вас 11 цз испытываютна рост при 55 С в разнообразных средах, используя при этом Вас 11 овЙоЬт 11 я ЛТСС 10774,Вас 11 ца атеагоФегпорЬ 111 в АТСС 12987, Вас 11 цзвтеагоФегпорЬ 1 з йй 81. В 1102; Вас 1 щсоаоиацв МВВ 1. В 1103; ВасЬв соадоапзИВВ 1. В 1168 и Вас 11 цз сЬепЫоппиИЙВ 1. В 1001Результаты испытаний приведены в табл. 2.В качестве питательного бульона (ПБ) слу.жит культуральная жидкость; содержащая 3 г/лмясного экстрькта и 5 г/л пентона. Среда М 2описана ранее, но в случае жидкой среды не .вводят агар,Результаты опытов показывают, что бактерииЯВЯМ В - 1102 не растут даже на питательномбульоне, АТСС 10744 не растет в присутствииметанола. Прочие культуры, размножаясь в присутствии метанола, не способны испольэоватьпоследний в качестве единственного источникауглерода и энергии для своего роста,Получаемая по йредлагаемому способу био.масса является ценным источником белковили протеинов для людей и животных, при,этом в случае потребления в качестве пищилюдьми клетки можно обрабатывать различными веществами для снижения содержания нукле.иновых кислот, а при употреблении же их вкачестве кормов для животных подобная обработка не обязательна.Ь 3 сц ЖОо Жо ДоР 1 йф з1 "31115 70 545 16 Тобл и ца Культура При мечан-) - отсутствие роста,Формула изобретени ользуют. бактерии Род1. Вили 1. Способ получения биомассы, предусматри. вающий выращивание микроорганизмов в условиях аэрации на питательной среде, содержащай окисленные утлеводороды в качестве источника углерода, источник азота и необходимые минеральные соли, отличающийся тем, что, с целью интенсификации процесса, выращивание осуществляют при 45 - 65 С, при этом в качестм личающиисяводят соль марган Составитель А,Бражникова.Техред Л.Алферова Корректэр О,Ковинская Редактор Е, Дай 526 Подпидарственного комитета ССизобретений и открытийЖ - 35, Раушская наб д аказ 7410 Тираж ЦНИИПИ Госу по делам 13035, МосквноеСР Рилиал ППП "Патент", г, Ужгород, уп. Проектн НВВ 1. В Нйй ВО 3АТСС 12987ййй 1. В 1168Нйй 1. В 1102АТСС 10774 ве микроорганизмов иВас 111 ца штаммы И ййЙВЯ 1. В,2. Способ по п. 1,что в питательную средуца. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе. Авторское свидетельство СССР У 553281,С 12 О 13/06, 1974,