Способ получения производных трипептидов

"Йейтиды16. иззодГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАЙ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧКНИяНЫХ ТРИГППТИДОВ общей Форм Н" Д-Х-Фен-Арг-Угде Х - Про, ФенОК 1, Ю; М 5 П С 07 С 103/52; А б нераэветвленный или разветвленный С-С-алкил или циклогек сил., водород, циклогексил, не- разветвленный или разветвленный С-С -алкил, отличающийся тем.,что С-защищенные производные аминокислоты или пептиды конденсируют в растворе в любой последовательности сактивированными сложными эФирами н-защищенных аминокислот или с М -защищенными аминокислотами и дициклогексилкарбодиимидом в качестве конденсирующего агента с последующим удалением защитных групп обработкой Фтористоводородной кислотой и выделением ко- Я нечных соединений с помощью ионообиенной хроматограФии.Сокращения, применяемые в описании: 45Аминокислоты (при отсутствии указаний на обратное, речь идет о Ь-конФигурации):Арг " аргининФен - фенилаланинПро - пролинАсОН - уксусная кислотаБок - трет-бутилоксикарбонил Кбо - карбобензоксиДЦКИ- дициклогексилкарбодиимид ДМФ - диметилформамидД 1 СО - диметилсульфоксидЭтй- триэтиламинЭтОЛс - этилацетатЭтОН - этанолНБТ - й-гидроксибензотриазол 60 МеОН - метанолОп НФ - п- нитрофе ноксии - ПРОН - изопропиловый спирт ТФА - трифторуксусная кислота ТСХ - тонкослойная хроматография 65 50 Изобретение относится к новомуспособу получения новых биологическиактивных соединений - производныхтрипептидов, которые могут найти применение в медицине.В синтезе пептидов широко используют при конденсации М -защищенныхаминокислот и пептидных фрагментовкарбодиимидный метод и метод активированных эфиров 1) с последующимудалением блокирующих групп обработкой фтористоводородной кислотой вприсутствии анизола при 0 С защищен-,ной по аминогруппе пептидной цепи 23,1(ель изобретения - получение но-,вых производных трипептидов, обладай щих интересными фармакологическимисвойствами.Поставленная цель достигается со"гласно способу получения производныхТрипептидов общей формулы 20Н-Д-Х-Фен-Арг-Угде.Х - Про, Фен;У - Ойтуз ИННА;К - неразветвленный или разветвленный алкил или циклогексил;К- водород, циклогексил, неразветвленный или разветвленныйалкил,эаключакцийся в том, что С-защищенные производные аминокислоты или пеп-З 0тица конденсируют в растворе в любойпоследовательности с активированными сложными эфирами Н-защищенных ами"нокислот или с М-защищенными аминокислотами и дициклогексилкарбодиими- Здом в качестве конденсирундего агента с последующим удалением защитныхгрупп обработкой фтористоводороднойкислотой и выделением конечных соеди,нений с помощью ионообменной хромато.рафии. Тонкослойная хроматографияДля проведения анализов методом тонкослойной хроматографии используются готовые к употреблению стеклянные пластинки с нанесенным на них силикагелем Ф, (фирма "Мерк") . В качестве растворителя используются следующие смеси (соотношения даны в объемных единицах):А - н-бутанол : АсОН ; вОда (3:2:1) Р - хлороформ : МеОН (9:1)Ра - хлороформ : МеОН: АсОН (17:2:3, Ра 6 . - хлороформ: МеОН: АсОН: Й О(34:4:У:2)М - н-бутанол : АсОН : Н О : пиРИдин (30:624 г 20)После окончания хроматографическо- . го раэделения стеклянную пластинку исследуют в УФ-области (254 нм), после чего обрабатываютее хлор/О-толуидиновым реагентом согласно известным способам. Конечным результатом проведения хроматографического разделения являются значения.П р и м е р 1 , Н-Д-Про-фен Арг -О-гептил 2 НС 1, мол,вес 589,6.1 а; Кбо-Феи-Арг(МО) -ОМе, мол.вес.514,527 Г 0,10 моль) Н-Арг(МОр)-ОМе фНС 1 растворяют в 4 мл диметилформамида и нейтрализуютпри охлаждении 18 мл триэтиламина, Получающийся при этом ЭтйНС 1 отделяют фильтрованием и добавляют к. реакционнОй смеси 42 г (0,105 иоль) Кбо-Фен-ОпНФ. Ре" акционную смесь оставляют на ночь при перемешивании, после чего из нее отгоняютв вакууме растворитель с по, лучением мачлообразного остатка, который растворяют в 500 мл этилацетата. Фазу в этилацетате промывают последовательно 2-ным раствором ЙОНС 0 . в воде, водой, разбавленным раствором соляной кислоты в воде и водой. После сушки над сульфатом натрия из смеси отгоняют этилацетат до объема около 200 мл и осаждают продукт введением эфира. кристаллический осадок промывают эфиром и сушат. В соответствии с данным ТСХ получается чистое вещество.Выход: 37,6 г ( 73 ) вещества 1 а.ТСХ: КЯ = О,52 (Р 1)1 Ь, Кбо-фер-Арг(ЙО)-ОН, мол,вес 500,5.3,1 г,(6,0 ммоль) вещества 1 а растворяют в примерно 150 мл мета нола и добавляют к полученному раствору 7,3 ммоль (7,3 мл/л 1 М ЮаОН в воде). СПустя примерно 4 ч из реакционной смеси отгоняют в вакууме растворитель, растворяют остаток в небольшом количестве воды и дважды промывают этилацетатом, Водную фазу подкисляют НС 1 до рН = 2 и экстрагируют образующийся при этом Кбо-Феь -Арг (НОВ)-Он тремя порциями этил 1034603 6соль брокистонодородной кислоты и -Фен-Арг -(Гф )-Н(-гептила содержит наряду с основным продуктам, иглеищим К в -0,61 (Ра), также небольшое количество побочного продукта с К. = =0,72 (Ра). Соль брокистоводородной кислоты подвергается ионообглену на колонке, заполненной "Я 71 Е" н хло"ридной фо 15 гле в смеси 90 этанола и 10 нодн, с использованием той же среди и качестве элюента. Фракция, )О содержащая в основном главный продукт н Форме хлорида отделяется в количестве 496 мг (1,0 мллоль)после че. го полученныг( продукт растворяют н 2 мл диметилформамида и нейтрализуют 5 0,15 мл тризтилакина. Затем,к полученному .таким способом растнору. добавляют 215 глг (1,0 ммоль) Бок-Д-Про "ОН, 135 глг (1,0 ммоль) НБТ и при охлаждении - 250 мг (около 1,2 ммоль)20 дициклогексилкарбодиимида. Реакции продолжают н течение 20 ч, после чего реакционную .смесь фильтруют и отгоняют растноритель в вакууме с образонаниегл маслообразной массы, которуи обрабатывают 2.-ннм раствором )аНСО н воде и чистой водой, Полу" ченную массу растворяют в метаноле и,хроматографируит на колонке, запойненной "Сефадексом ЛН" в метаноле с использованием метанола в качестве элиента. Из фракции, содержащей чистое вещество 2, отгоняют рас творитель н вакууМе и внцелачивают остаток водой. Полученную кристаллическу",о массу сушат в вакууме.Б,1 ход: 457 мг, (69) вещества 2 Ъ.ТСХ: К =0,35 (Р 1,).2. -Д-Про-Фен-Арг-ГН-гептил2 НС 1, монес 588,6.Для ЗОО кг соединения 2 Ь проводят 40 удаление за.:.;цтных групп и очистку согласно прцглеру 1.Выход: 263 глг (98) продукта 2, с(3 +11,6 (С,О,6, 50-ная уксуснаякислота) . 45ТСХ; Р, .=0,25 (А ), .только одно пятно,Анализ на аминокислоты: Арг 1,00, Фен 0,97; Про 0,98.и р и к е р 2. Н-Д-Про-Фен-Арг-(Н НС 1, мол. нес 490,5.За, Бок-Д-Про-Фен-ОМе, мол.вес 376,4.4,2 г (195 ммоль) Бок-Д-Про-ОН и 2, г (,20,0 ммоль) НБТ растворяют н 50 мл дииетилсульфоксида и добавляют к полученному раствору при перемешинании и охлаждении 4,4 г ( около 21 кколь) дицикйогексилкарбодиимида, К реакционной смеси добавляют раствор 4,З г (20,0 ммоль) Н-Фен-ОМе-НС 1 в 50 кл диметилформамида, предварительно нейтрализованного при охлаждении добавлением 2,8 мл (20,0 ммоль ) три- этиламина с последующим Фильтрованием. Реакционную смесь останляют йа ночь и отфильтровынают образующийс65 ДЦУ, Растноритель отгоняют досуха сполучением из реакционной смеси маслообразного остатка, который растноря. -ит н 300 мл.этилацетата, Раствор вэтилацетате последонательно пролювают 2-ным водным раствором Й.аНСОу,водой, 2-ным водным раствором КНЩ и наконец водой, послечего сушат над сульфатом кальция,.Раствор в этилацетате подвергают. вакуумной разгонке досуха с получением кристаллической массы, которую обрабатываютпетролейным эфиром; Фильтруют и пролываит петролейным эфиром Полученнуюкристаллическую массу, сушат н вакууме,.Выход: 5,5 г (75) вещества За.ТСХ: ЙУ =0,53 ( Р 1).ЗЬ. Бок-Д-Про-Фегг Н мол. вес362,44,5 г (12,0 ммоль). вещества Зарастворяют в 50 мл МеОН и добавляютк полученному раствору 15 мл 1 н. ЙаОН(,15 ммоль), После переглешивания ре-акционной смеси при комнатной .температуре в течение 2-3 ч растнорительотгоняют досуха, а -полученный остатокрастворяют в 100 мл воды и дваждыпромывают 50 мл эфира, после чегоподкисляит водную Фазу КН 504. до рН 3.После перемешивания при ООС в течение 30 мин реакционной смеси образующийся в ней осадок отфильтровываюти промывают небольшим количествомхолодной воды, после чего сушатуказанный осадок н вакууме.Выход 3,3 г (74%) соединения 35,ТСХ: 1 =0,81 ( Раб).Зс. Бок-Д-Про-Фен-Арг Й , -ИНмол.вес 5 Ь 2,б.0,65 г ( 1,8 ммоль) соединения Зби 0,26 г (1,У ммоль) НБТ растворяютн 10 мл диметилформамида и добавляклк полученному раствору при перемеиивании и охлаждении 0,38 г (около1,8 ллглоль) дициклогексилкарбодиимида,К реакционной смеси добавляют растворО,б г (2 мглоль) Н-Арг(МР)-МН 2 НВгн 10 глл дикетилформамида (которыйследует нагреть и вновь охладить перед нейтрализацией), который предварительно нейтрализуют при охлажденииО,З мл (2,2 ммоль) триэтиламина, икоторнй затеи Фильтруют. Реакционнуюсмесь оставляют на ночь и отфильтровывают затем образующийся ДЦУ. Из реакционной смеси отгоняют растворительс образованием маслообразного остатка, которнй растворяют в кипящем "этилацетате ( 100 мл). При охлажденииобразуется осадок, которчй промываютэтилацетатом и эфиром. Затем укаэанный осадок (около 0,5 г ) растворяют.в большом количестве этилацетата йпромывают последовательно 2-нымводным раствором МаНСО, нодой, вод-,ным 2-ным раствором КЯфО и сноваводой. Раствор в этилацетате сушат1034603 Д-Про-Фен-Арг-О- геп 10 100 100 1015 15 0 0 0 Н-Д-Про-Фен-Арг- М 5 10" 0 100 5 0 0 о-,фен-Арг-О-и-пропи Ф 0 50 Фен-Фен-Арг" КН2 5 10 5 10 3 бором для измерения силы фирмы фГрасс" ГАФТ-ОЗС), сопряженным с регистрирующим самописцем той же фирьы.Регистрируются сокращения мускулов под воздействием брадикинина при концентрации его от 10-фадс 10и 5 (моль/л), после чего определяют концентрацию традикинина, вызывающую 70 максимальных сокращений мускулов .ЕД), Вслед за этим исследуется ингибирующаяактивность по отношению О к брадикиннну соответствующих трипептидных производных, при их концентращи в бане, равной 10-8, 10 т, 10 и 10 6 Й при концентрации брадикинина, соответствующейЕД, по 15 Н-Д-Про-Фен-Арг-МН-гептил отношению к соответствующим мускулам.Для каждой из указанных концентрацийсоответствующие трипептидные производные вводятся в ткань матки за 5и 10 мнн до введения брадикинина.Активность по отношению к ингибированию воздействия брадикинина выражается в виде промежутка времени, необходимого для того, чтобы брадикининвновь вызвал первоначальное сокраще"нне мускулов. После каждого введениябрадикинина производится промывкабуферным раствором,Результаты биологических испытаний,приведены в таблице..Ужгород, ул.Проектная, 4 т 651/61 Тир ВНИИПИ Госуда по делам иэ 113035, Иоскваж 418ственногобретенийЖ, Р 1010смите откры ушская Подписное СССРйаб., д.4/5