Штамм облигатно-метилотрофной бактерии всб-792

89867 2 танола.Получение микробной биомассы наоснове метанола - один из эффективных путей. обеспечения народногохозяйства и, в первую очередьживотноводства белково-витаминнымиконцентратами. Планами развития народного хозяйства предусматриваетсяорганиэация крупнотоннажного промышленного производства микробной биомассы из метанола, как источникакормового белка и витаминов.Создание отечественного фондакультур, активно растущих за счетметанола и обладающих ценными дляпроизводства признаками, являетсянеобходимым условием развития такого производства и представляетсобой важную народнохозяйственнуюзадачу.Известно много различных штаммов бактерий-метилотрофов, способных развиваться за счет метанола 11,Систематика этих бактерий малоразработана и многие из селекционированных штаммов их авторы относят к новым видам и даже новымродам, не описанным в существующихопределителях, в частности в наиболее полном определителе бактерий(Вегееуя шапиа 1 ой Ое 1;егт 1 паГгчеВасгегго 2 оду, 1974,8-ТЬ ЕЙ 1 г 1 оп,Ва 1 гдшоге, (ДАБЛ) .Большинство известных штаммов метилотрофных бактерий охарактеризовано, однако, лишь в условиях периодического культивирования или не представляет практического интереса благодаря недостаточно высоким для промышленного применения показателям.Из числа известных штаммов основнаямасса принадлежит факультативнымметилотрофам, способным помимо метанола потреблять источники углерода,содержащие два и более углеродныхатома,10 15 20 25 30 35 40.Значительно меньше найдено облигатных метилотрофов, хорошо растущих только за счет одноуглеродных соеди пений, в частности метанола,В СССР штаммов облигатных метилотрофов нет, а для получения белково 9Изобретение относится к области микробиологического синтеза белка и физиологически-активных соединений и представляет собой новый штамм бактерий - продуцент белково- витаминной биомассы на основе мевитаминной биомассы из метанола предложены два факультативно-метилотрофных штамма Ряецйотопая шегЬапо 11 саяр. печ, и КИ23, Но эти штаммыочень неустойчивы к инфицирующеймикрофлоре, полностью вытесняютсяпосторонней микрофлорой из процесса,обладают сравнительно низкой скоростью роста, растут при скоростипротока 0,16-0,18 ч с невысоким выходом биомассы (около 407), уступаяпо указанным показателям облигатнометилотрофным штаммам, предлагаемымза рубежом.Наиболее близким к предложенномуштамму по технической сущности, физиолого-биохимическим и культуральным признакам является облигатно-метилотрофный штамм Мегйу 1 оЬасг 11 ия1 исояепея реп, поч, яр, поч. 3.Это облигатный метилотроф и облигатный аэроб, хорошо растущий наминеральной среде с метанолом при30 С и рН 6,8-7,0. Из источниковуглерода использует только метанол иметиламин. Морфологически. представляет собой неподвижные на всех стадияхпалочки, размером 0,5-0,8 х 1,0-1,6 мкм,встречающиеся поодиночке и парами,спор не образует. Окраска по. Граммуотрицательная, тест на каталазуположительный, Колонии на синтетической среде с метанолом округлыедиметром около 0,4 мм, блестящие,гладкие, непигментированные, Молярное содержание гуанина и цитозинав ДНК составляет 54,1 молярных 7.Поли-ф-оксимасляной кислоты не накапливает, но в определенных условияхлимита по азоту образует гликогеноподобное вещество. Оптимальная температура - 30, при 37 С рост прекращается. При оптимальных значенияхтемпературы и рН (около 7) максимально короткое время удвоениясоставляет 2,9-3,5 ч, что соответствует скорости роста 0,28-0,43 чШтамм испытан при периодическомвыращивании в условиях качалочныхопытов, По выходу биомассы и содержанию в ней белка штамм не охарактеризован,К недостаткам штамма, которыевыявляются даже в условиях периодического выращивания, относятсянедостаточно высокая скорость ростаи низкий температурный оптимум.Цель изобретения состоит вселекции нового штамма мет .лотрофных989867 4ки не обнаружены, Размеры односуточных клеток с синтетической среды 0,3-0,5 х 1,5-1,8 мкм, размножаются би нарным делением, спор не образуют.Окраска по Грамму отрицательная. Колонии на агаризованной синтетическойсреде с метанолом округлые до 05 ммв диаметре, выпуклые, с гладкимкраем, блестящие, полупрозрачные,непигментированные. 15 20 25 30 35 Штамм МеЬу 1 оЬас 111 цз шесЬу 1 орЬ 1- 1 цз ВСБдепонирован в централь- ф ной коллекции промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика" Главного управления микробиологической промышленности при Совете Министров СССР под номером ЦМПВ50В.Штамм ВСБхарактеризуется следующими свойствами.Морфологические признаки.Клетки в форме палочек с закругленными концами, расположенное поодиночке или попарно, могут образовывать длинные нити, неподвижны, жгутизбактерий с улучшенными свойствами, Для достижения цели предложен штамм облигатно-метилотрофной бактерии МеЬу 1 оЬас 11 цз шеЬу 1 орМ 1 цз ВСБ(коллекция Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов) - продуцент белково-витаминной биомассы.П р и м е р 1. Предлагаемый штамм МесЬу 1 оЬасП 1 цз шейЬу 1 орЬ 11 ВСБвыделен из бактериального комплекса, спонтанно образовавшегося в процессе непрерывной ферментации метанола в нестерильных условиях при рН 6,8-7,0.Идентификацию предлагаемого штамма проводили по определителю бактерий (Вегеуз шапца 1 ой, 0 еегш.ЗасС 8-еЬ. Ед, Ва 1 С, ОБА) и описаниям облигатных метилотрофов в оригинальных статьях, перечисленных в табл. 1, Из таблицы видно, что по сумме признаков предлагаемый штамм ВСБближе всего подходит к облигатно-метипотрофным бактериям рода МеСЬу 1 оЬас 111 цз. Предлагаемый штамм как и бактерии рода МеЬу 1 оЬас 11 цз, помимо ряда общих с другими облигатными метилотрофами признаков, отличает отсутствие подвижности, отсутствие пигментации и близкое молярное соотношение в ДНК суммы гуанина и цитозина. На основании сходства морфологических и культуральных признаков заявляемый штамм ВСБотнесен к роду МеЬу 1 оЬас 11- 1 цз и на основании имеющихся отличий от единственного известного вида этого рода МеЬу 1 оЬас 111 цз я 1 цсояепез (см. таблицу) определен как новый вид МеТЬу 1 оЪас 111 цз шеЬу 1 орМ 1 цз зр. поч. физиологические и культуральныепризнаки.Облигатный аэроб, максимум ростапри рН 6,8-7,0 и температуре 30"ЗУС,хорошо растет при 37 С. Облигатныйметилотроф. Не использует соединенияс двумя и более углеродными атомамифспирты (этанол, пропанол, изо-пропа"нол, н-бутанол, изо-бутанол, амиловый и иэоатиловый спирты, глицерин,маннит, дульцит), органические кислоты (формиат, ацетат, оксалат, гликолат, пируват, лактат, пропионат,сукцинат, бутират, фумарат, малат,малеат, О -кетоглутарат, цитрат),сахара (глюкозу, фруктозу, сахароэу,галактозу, ксилозу лактозу, мальтозу, рамнозу). Иэ С-соединений хороФшо растет только на метаноле. Метан,метиламины, формальдегид и формиатне потребляет,Не растет на обычных средах - молоке, мясо-пептонном агаре (МПА),мясопептонном бульоне (МПБ), мясопептонной желатине. В качествеисточника азота использует соли аммония, хуже нитраты. Нитриты из нитратов не образует. Сероводород,индол, поли-р-оксимасляную кислотуне образует, но может выделять всреду большое количество слизи (полисахариды).Ауксоавтотроф, в витаминах и других дополнительных факторах ростане нуждается. Тесты на каталазу иоксидазу положительны. Молярноесодержание гуанина и цитозина в ДНКсоставляет 55,7+0,4 молярных 3.Предлагаемый штамм ВСБнепатогенен,Штамм ВСБхорошо растет наминеральных средах с метанолом свысокой скоростью роста до 0 =50 55 более 807 к сухому весу, а также соединенный витаминной и коферментной природы, в частности витамина 1 В, до 100 мкг/г, иэ них до 70 мкг/г в коферментной форме в виде флавинадениндинуклеотида (ФАД), а также более 1000 мкг/г никотинамиддинукле-. отида (НАД-кофермента).Штамм стабилен при непрерывном выращивании, легко поддерживается в лабораторных условиях, нелиэогенен,Предлагаемый штамм МеЬу 1 оЬас 11- 1 цв вейу 1 орЬ. ВСБотличается от наиболее близкого прототипа МейЬу 1 оЬас 11 цв я 1 цсодепев по следующим признакам: не использует, метил- амин, не накапливает гликогеноподобного вещества при дефиците азота, обладает более высокой скоростью роста - Д = 0,5 ч ", вместо Д - 0,28- 0,34 ч " у прототипа (или по минимальному времени удвоения - 2 ч по сравнению с 2,9 ч у прототипа) хорошо растет в более широком интервале температур: у прототипа при 37 С рост прекращается, а заявляемый штамм продолжает развиваться прио37-38 С. Влияние температуры на рост заявляемого штамма представлено в табл. 2Иэ таблицы видно, что предлагаемый штамм ВСБодинаково хорошо растет при 30 и 35 С, а при 38 фС отмечается лишь небольшое снижение выхода,П р и м е р 2. Штамм Мейу 1 оЬас 111 цз веСЬу 1 орЬ 11 цв ВСБвыращивали непрерывным споообом в асептических условиях в лабораторных аппаратах 0,7 л с полезным объемом 0,3 л при рН 6,8-,0 и 30 С на среде состава г/л: КС 1 69,5МАЗО, 7 Н,О 18,2РеЯОс .7 Н,О 4,8ХпБО 1 7 Н О 3,3МпБО -5 Н О 3,6Сц 80 5 Н 0 0,4Н,РО (70%) 58 мл Концентрация метанола в притоке составляла 17,. Источником азота служил аммиак, который вводили по мере подкисления среды.Выращивание проводили при скорости протока Д,25 ч ". В этих условиях выход биомассы по абсолютно сухому веществу к заданному метанолу составлял в среднем 527 Биомасса содержала в пересчете на абсолютно .сухоевещество 85% сырого протеина,106:мкг/г витамина В 70 мкг/лфлавинадениндинуклеотида (ФАД)1200 мкг/г никотинамиддинуклеотида(НАД), 3-87 липидов,П р и м е р 3. Штамм МеЬу 1 о 10 Ъас 111 цв веЬу 1 орЬ ВСБкультивировали так же как в примере 1, нопри 35 С, при той же, что в примере 1 скорости протока Д,25 ч ",Выход биомассы по абсолютно сухому15 веществу к заданному метанолу составлял 527.П р и м е р 4. Штамм МеСЬу 1 оЬас 111 цз веЬу 1 орЬ 11. ВСБ культивировали в тех же условиях,20 что и в примере 1, но при температуре выращивания 38 С. Выход биомассы к заданному метанолу составлял 477.П р и м е р 5. Штамм Мейу 1 о 25 Ъас 111 цв вейу 1 орЬ 11 ВСБкультивировали тем же способом, что ив примере 1, но в аппаратах емкостью 30 л, в нестерильных условияхи скорость протока доводили доД,4 ч 1. Выход биомассы по абсолютно сухому веществу при скоростипротока Д,4 ч " составлял 547 кзаданному метанолу, содержание сырового протеина доходило до 857.За 140 ч выращивания в нестерильныхусловиях штамм не вытеснялся иэпроцесса инфицирующей микрофлоройи не менял своих свойств.П р и м е р 6. Штамм МеТЬу 1 оЬас 111 цв веЖу 1 орЬ 11 цв ВСБ культивировали так же и в тех жеаппаратах, что в примере 4, но скорость протока доводили до Д,5 ч"1,Выход биомассы по абсолютно сухому45 веществу к заданному метанолу приД в ,0,5 ч " составлял 467,Таким образом, селекционирован новый штамм облигатно-метилотрофной бактерии МеСЬу 1 оЬас 111 цв весЬу 1 орЬ. ВСБс улучшенными свойствами, способный активно развиваться на средах с метанолом с высокой скоростью роста до Д,5 ч ", в широких пределах температуры до 38 С с оптимумом 30-35 С и обеспечивать высокий выход биомассы, более 507 к заданному метанолу. Штамм образует более 80% сырого протеина, а также79898ценные соединения витаминной и коферментной природы, в частности, витамин В, около 100 мкг/г сухого веса,в том числе около 70 мкг/г в видефлавинадениндинуклеотида (фАД) иболее 1000 мкг/г никотинамиддинуклеотида (НАД-кофермент), Штамм вы 1деляет в среду в определенных условиях большие количества полисахарида, который может иметь практи- щческое значение,Штамм МеСЬу 1 оЬас 111 из шесЬу 1 орЬ 11.ВСБпредставляет собой первуюв СССР культуру облигатно-метилотрофных бактерий. Этот штамм, как продуцент белково-витаминной биомассы,не уступает по промышленно-Ценнымсвойствам лучшим зарубежным штаммамоблигатно-метилотрофных бактерий,предлагаемым для производства микробной биомассы на основе метанола ипо некоторым показателям превосходит их, Заявляемый штамм имеет существенные преимущества перед факультативно-метилотрофными бактериями,в том числе используемыми в СССР вкачестве продуцентов микробной биомассы на основе метанола РзецйошопазшеЬапо 11 са и Рзецйошопаз КУ.Сравнение показателей селекционированного штамма МесЬу 1 оЬас 111 цз30 67 8шеСЬу 1 орЬ 11 цз с используемыми в СССР факультативно-метилотрофными штаммами представлено в табл. 3.Из представленной таблицы отчетливо видны преимущества заявляемого штамма перед используемыми в настоя- . щее время в СССРПрименение предлагаемого штамма позволит за счет более высокой скорости роста, способности к росту в более широких пределах температуры, а также высокому выходу богатой белком биомассы и большей устойчивости к вытеснению инфицирующей микрофлорой в два с половиной раза уменьшить стоимость биомассы на метаноле, обеспечить более стабильный процесс с меньшей вероятностью вытеснения продуцента при инфицировании, а также расширить общйй фонд имеющихся облигатных метилотрофов и фонд штаммов-продуцентовбелково-витаминной биомассы иа основе метанола, имеющийся в СССР.Экономия от внедрения предлагаемого штамма вместо используемого в настоящее время для опытной установки производительностью по микробной биомассе 10 тыс. т в год составит по предварительным расчетам 530 тыс, руб,Д о в о а 10 о а О 1 сб ха ео хД Эе х. нО Ха ио х хЪ , Ж 3 Б м х х а д х о о х х 111,хХ111 о х Я 1О ОО ОО о о1 б,с: ц43ЭЕ ьб 1 А 3 х а о Э И А о х ом оо лг 4 1 1 11 1 Е Э Р 1 о о х 4 Э О ;Г х 0 о о + л л л Ю м 1 х Ех о 1 Щ о м Д й о И х о а б аЭ (бц хо хо Х1 б Хэхох оаэ "х хцх 2О Об х л ц Э 1 б а хА О 1 Я Э Х С Э12 989867 Таблица 2 Выход биомассы у штамма ВСБ в условиях непрерывного выращиванияпри разных температурах Температура, Длительность Выход биооС процесса, ч массы в Ек метаиолу 30 100 100 53 38 100 Таблсица 3Сравнительная характеристика Мейу 1 оЪас 111 цз шейЬУ 1 орЬ 11 ив ВСБ и штаммов, используемых в СССР - Ряеийошопав шеСапо 1 са вр. поч.и КИпри выращивании в одинаковых условиях Предлагаемый штамм ВСБПоказатели культур Используемые штаммы КИ30; повышение до 37подавляет рост 30-35 выдерживает 38Пределы температуры для роста,С Достигнутая скорость протока в непрерывной культуре, ч 0,25-0,50 0,16-0,20 Выход по сухому веществу,Е к метанолу 46-54 36-40 Белок (сырой потеин), 7 ксухому веществу 80-85 Витамин В мкг/г сухоговещества 106 69 Устойчивость к инфицированию Сохраняется в нестерильных условиях Вытесняется целиком Техред Т.Дубинчак Корректор В. Гирняк Редактор Л. Утехина Заказ 7019/1 Тираж 524 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5 Филиал 1 Ш 11 "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4