Способ выявления хламидий

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 1789904 А й 1/30, С ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕВЕДОМСТВО СССР(56) Лабораторннарии: Вируснытарные болезниАнтонова. М.; АгЛабораторн ИЛИИ микробиособ вытовление бацию и красите- толуидие при рН епаратов бл. МЗ ельс яйственн вич, В. Бортничук и ые иссле е, риккет : Справоч ропромиз ое дело, 1 ования лозные ик/По ат, 198 88,МЗ в ветерии паразиред, Б,М. , с. 20-33. с. 76- 77. Изобретение относится к ветеринарии, в частности к микробиологии и хирургии, и может быть использовано в качестве одного из этапов диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных,Способ выявления хламидий может найти применение при непосредственном обнаружении корпускул хламидий в мазках из патологического материала, а также в гистологических срезах, приготовленных из пораженных органов и тканей, окрашенных толуидиновым синим. Особое значение способ приобретает в процессе прижизненной диагностики хламидиоза, осуществляемой путем выявления хламидий в кляч-препаратах, приготовленных из биопсийного материала,Хламидий в препаратах-отпечатках и гистологических срезах достоверно выявляют иммунофлуоресцентным методом. Однако этот способ применяется только в хорошо оснащенных лабораториях, требует дефицитных реактивов, сложного оборудования и дает весьма нестойкие препараты, непригодные к длительному хранению и повторному излучению. В диагностике хламидиоэа в условиях обычной лаборатории или хозяйства этот метод прак(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ХЛАМ (57) Использование: ветеринарная ология. Сущность изобретения: сп явления хламидий включает приго препаратов, их окрашивание, инку микроскопию, при этом в качестве ля используют 0,1-ный раствор нового синего в ацетатном буфер буфера 4,2-4,5, а инкубацию пр проводят в течение 15 - 20 мин, 1 та тически неприменим; к тому же он требует затрат большого количества времени.Аналогичным недостатком обладает также метод выявления корпускулярйых частиц хламидий в препаратах, окрашенных акридиновым оранжевым, приготовленным на фосфатно-цитратном буфере,Близкой по технической сущности к изобретению является окраска хламидий по Романовскому-Гимза, которая дает весьма нечеткие результаты, поскольку краситель сильно закрашивает фон препарат-отпечатка, а на гистологическом срезе вообще неприменим. Кроме того, при данном способе окраски хламидии трудно отличать от клеточного детрита и остатков красителя.Окраска хламидий по Стемпу карболфуксином возможна только на препаратах- отпечатках. Способ требует отмывки избытка красителя (дифференцировка) и докраска малахитовым зеленым для образования фона, на котором будут видны хламидии, Этот метод требует известного мастерства и интуиции. Окраска гистологических срезов этим методом практически невозможна.Окраска хламидий по методу Маккиавелло фуксином основным с докраской препара- та метиленовой синью характеризуется теми же недостатками, что и приведенный выше способ, Это же относится и к другим почти идентичным способам выявления хламидий,Наиболее блйзким к изобретению является метод обнаружейия включений Сп 1 агпубеа тгаспоеаОз в патологическом материале. Метод йрМуЮаЪ риЬает окраску препаратов смесью ьИТй 7 гового зеленого и нейтрального красного с добавлением ДМСО, Затем препараты с нанесенной окрашивающейей смесью ин кубируют 10-15 мин в термостате при 37 С с последующей микроскопией, Однако данный метод рассчитан на выявление компактных колоний, характерных для СЫаеудеа тгаспоеат 1 з, ло- кализующихся в клетках. Информативность его значительно снижается в отношении хламидий, находящйхся вне клеток.Целью изобретения является более точное выявление хламидий напрепаратах-отпечатках и гистоЛогических срезах в" процессе диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных, При этом можно проводить исследовайия на месте, непосредственно в хозяйствах, где представляется возможным использование светового микроскопа, Препараты-отпечатки получень 1 из поверхности слизистых оболочек, паренхиматозных органов, семенников, суставной жидкости, плодовых оболочек и отделяемого родовых путей (в случае аборта . или патологических родов); Предлагаемый способ вместе с проведением биопсии печени, легких, семенников или пункций пораженных суставов дает возможность непосредственно-на месте ставить прижизненный диагноз и проводить необходимые лечебно-профилактические мероприятия.Применение предлагаемого способа приокраске гистопрепаратов, кроме того, дает возможность увязать наличие хламидий с определенными патогистологическими и патоцитологическими изменениями, что позволяет верифицировать диагноз и углубить изучение болезни, в частности патогенеэ; выяснить изменение хламидий в связи с использованием лечебных средств, наличие полной или частичной санации различных органов и тканей,Эта цель достигается тем, что хламидий содержат обе нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК), и их обнаружение в препаратах-отпечатках йтйстологйческих срезах предлагается осуществлять при помощи гистохимических реакций, используемых для суммарного выявления нуклеиновых кйслот,Препараты-отпечатки готовят из свеже- иссеченной поверхности кусочка оргайа или5 10 15 ткани, полученного после убоя или гибели животного, а также хирургическим путем при жизни (метод биопсии). У молодняка и плодов, в том числе абортированных, хламидии локализуются в печени, селезенкЕ, почках, легких, мезентериальных лимфоузлах, семенниках, капсуле суставов, стенке сухожильного влагалища, конъюнктиве, Препараты также готовят из плодынх оболочек абортировавших коров и свиноматок, из отделяемого родовых путей (после аборта или патологических родов), семенников производителейСвежеиссеченный острой бритвой или скальпелем отобранный кусочек материала ополаскивают физиологическим раствором с целью удаления крови с его поверхности, затем осторожно прикасаются к обезжиренному в спирт-эфире предметному стеклу.При этом клетки с поверхности разреза прикрепляются к стеклу, причем в первую оче 20 редь прилипают подвижные клеточные элементы (моноциты и макрофаги), инфильтрующие орган или ткань в связи с хламидиозным воспалением. Лейкоциты при данном процессе отсутствуют или встречаются очень редко. Кроме моноцитов и макрофагов на стекло хорошо переходятпаренхиматозные клетки, инфицированные,. дящей концентрации (100, 96, 70) 45 50 55 ополаскивают ацетатным буфером (рН 4,2- 4,5) и помещают в рабочий раствор (1:1000) толуидинового синего, приготовленного на указанном буфере, Время окраски 10 - 15 мин. Затем срезы подсушивают фильтровальной бумагой, высушивают в термостате при 37 - 40 С в течение 1 ч, просветляют ксилолом, наносят каплю бальзама, накрывают покровным стеклом и исследуют с помощью обычного светового микроскопа под средним и иммерсионным увеличением.Окраску препаратов-отпечатков рабочим раствором толуидинового синего проводят по. хламидиями и теряющие прочную связь ссоседними элементами,Приготовленные препараты подсуши, вают на воздухе, помещают в чашку Петриотпечатками вверх на фильтровальную бумагу, предварительно пропитанную 40 О раствором формальдегида (формалина), и закрывают крьшкой. Препараты оставляют при комнатной температуре в течение 12 ч или в бытовом холодильнике при 4 С на 24-48 ч, что приводит к нежной их фиксации парами формальдегида, Фиксированные таким способом препараты-отпечатки можно хранить в чашках Петри в холодильнике на 40 протяжении нескольких месяцев,Из исследуемых тканей готовят такжепарафинированные срезы, которые депарафинируют, проводят через этанол нисхоаналогии с гистосрезами в химических ста- разведение толуидинового синего 1:1000 канчиках, придавая предметному стеклу испытанос различной концентрацией водо- вертикальное или наклонное положение, родных ионов в растворе. начиная с рН 4,0 Профильтрованный раствор красителя мож- до 4,8 с интервалом в 0,1, Максимальную но наносить и на горизонтальную поверх контрастность маркировки хламидий уданость препарата. Окраску проводят влось получить при рН раствора толуидинотечение 15-20 мин при комнатнойтемпера- вого синего 4,2-4,5, Именно при такой туре или (лучше) в термостате при 37 С. За- концентрации водородных ионов толуидитем препараты дифференцируют ксилолом до новый синий наиболее отчетливо выявляет наступления просветления, наносят каплю внутриклеточные и внеклеточные формы пихтового или канадского бальзама, накры- хламидий. Первые в виде мелких (0,2-0,810вают покровным стеклом и исследуют под мкм) образований круглой или овальной обычным световым микроскопом при сред- формы определяются в цитоплазме заранем и иммерсионным увеличениях. женных клеток, формируя иногда рыхлыеТолуидиновый синий относится к основ- колонии. Окраска ядра и цитоплазмц не меным красителям ф-лы 15 шает обнаружению хламидий, так как ДНКи МНв клетке содержится главным образом в яд)СЯ 12 ре, а РНК - в цитоплазме, в связи с чем3)2СНинтенсивность окраски этих клеточныхВструктур в два-три раза меньше, чем микро- Он взаимодействует с фосфатными группа организма, содержащего обе нуклеиновые ми нуклеиновых кислот и в слабокислой сре- кислоты; кроме того, концентрация нуклеи.- де при рН 4 - 5 дает синее окрашивание новыхкислотнаединицуобъемавхламидиклеточных и субклеточных структур. Реак- ях в несколько раз больше, чем в клетке, где ция красителя с обеими нуклеиновыми кис- паразитирует микроорганизм.лотами протекает более интенсивно Одновременно при таком методе опре(примерно вдвое), чем с белками или проте деления хламидий выявлено специфическое огликанами, с которыми толуидиновый си- изменение хламидийных телец за пределаний также способен связываться своими миклетки,кудаонипоступаютвсвязисразруреакционноспособными группировками. В шением инфицированных клеточных связи с этим при сравнительно высоких сте- элементов. Здесь элементарныетельца хламипенях разведения красителя толуидиновый 30 дий в силу неблагоприятноговоздействия сресиний относительно слабо окрашивает фо- ды претерпевают выраженные морфологиновые структуры, довольно отчетливо, одна- ческие изменения, которые могут быть использоко, марки руя хламидий. ваны в диагностировании зараженного этимОпытным путем подобрана концентра- видом паразита материала. За пределами ция красителя, которая оказалась наиболее 35 клетки отдельные тельца хламидий сравни- оптимальной в разведении толуидинового тельно быстро увеличиваются в размерах, как синего 1;1000. Важную роль в специфично- бы разбухают, и внутри них возникает вначале сти выявления нуклеиновых кислот играет точечное, а затем все более увеличивающееся рН раствора красителя. При рН последнего просветление.Вследствиеэтогообразуютсявесьма.4,6 в структурах цитоплазмы и ядра только характерныекольцеобразныеструктуры,покрытые нуклеиновые кислоты сохраняют резко вы снаружи гликолипопротеидной оболочкой, что раженный отрицательный заряд, Осталь- помогает легко дифференцировать хламидий в ные компоненты цитоплазмы, в том числе препаратах-отпечаткахигистологическихсрезах. белки, заряжены положительно или слабо Предлагаемый способ также выявляет и отрицательно, в результате чего краситель инициальные(ретикулярные)тельца хламидий, ими почти не связывается. 45 которые имеют обычную конфигурацию и расЧем дальше рН раствора сдвигается в полагаются скоплениями различной величины. щелочную сторону, тем больше белков учв- Данные по зависимости качества иденствует в связывании основных красителей, тификации от параметров способа приведетем менее специфической в отношении нук- ны в таблице.леиновых кислот становится адсорбция Данные таблицы свидетельствуют о этих красителей. В кислой среде, начиная с значительном преимуществе выявления рН 2,0, ДНК и РНК легко денатурируот, что хламидий путем окрашивания препаратов приводит к изменению сорбции основных 1:1000 растворомтолуидиновогосинегоприрН красителей припостановкереакциинанукле,2 - 4,5, лучше при 37 С (хорошие результаты иновые кислоты, что ухудшает их выявление, получены окраской при комнатной температуДля определения максимальной специ ре). Четкая контрастность хламидий обеспечифичности в целях обнаружения хламидий вает постановкудостоверногодиагноза,1789904 точности способа, в качестве красителя используют 0,1-ный раствор толуидинового синего в ацетатном буфере при рН буфере 4,2 - 4,5, а инкубацию препаратов проводят в течение 15-20 мин. Время окрашивания, мин Температурараствора, С Степень контрастности Количество выявляемыххлами ий,12 1518 37 42 80 84 92 Формул а изо бр ете н и яСпособ выявления хламидий, включающий приготоаление препаратов, их окрашивание, инкубацию и микроскопию, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения . Краситель, его рН раствораконцентрация 18 37 18 37 42 18 37 42 18 37 . 42 37. 42 , 1837 42 17 25 28 18 25 24 18 26 22 26 34 38 22 46 62 50 62 70 Слабая контрастность выявляемых хламидий за счет нарастающего закрашивания фона.Слабая контрастность, не все хламидии окрашиваются Достаточный контраст межфоном и хлэмидиями, однако хорошо выявляются только элементарные (зрелые) тельца Количеств выявляемыххламидий значительно возрастаетПродолжение таблицы Высокая степень контраст- ности окрашиваем ых хламидий Полное выявление хламидий за счет оптимизации гистохимических реакций при 37 ОС Ухудшение контрастности окрашиваемыххламидий, закрашивание фонаН изкая степень контрастности окрашиваемых хламидийСохраняется средняя степень контрастности окрашиваемых хламидийУсиливается контрастность окраски промежуточных телец хлами- дий Средняя степень контрастности окрашиваемых хламиВысокая степень контрастности окраши. ваемых хламидийСнижение контрастности, закрашивание она1789904 Продолжение таблицы 5,0 18 37 42 Толуидиновы йсиний 0,1 % 12 32 38 Очень слабая контрастноть, заметное окрашиваниефонаНекоторое усилие контрастаокраски зрелых телец хламидийЗаметное на 10 18 37 42 15 36 50 12 18 37 42 18 37 42 22 40 54 26 42 56 растание ин,тенсивности 15 закрашивания фона цитоплазмы клеток и ухудшение выявления хламидий Слабая контрастность в связи с закрашиванием фонаУхудшение выявлени.я хламидий в связи с закрашиванием фонаОчень плохая 20 18 37 42 30 44 50 25 18 37 42 40 38 24 40 18 37 42 20 18 16 контрастность хламидий в связи с закрашиванием фо- на Толуидиновый синий 0.01 % Толуидиновый синий 120 20 18 Слабое окрашивание хламидий, плохая контрастность Удовлетворительное окрашивание, плоРомановского Гимэапо стандарту 37 38 хая контрастность При всех значениях рй; температурных режимах и экспозициях хламидиизакрашиваютя очень плохо; ойи слабо заметны на неокрашенном фоне,При всех значениях рН, температурных режимах и экспозициях происходитсильное закрашивание фона, в связи с чем хламидий обнаружить не удается1789904 13 Продолжение таблицы 32 42 42 20 Метод Стемпа (стандартный) 15 37 48 43 42 Редактор Г.Бельская Закээ 346 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 45 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Составитель О.ПетренкоТехред М,Моргентал Корректор С.Юско Интенсивное закрашивание цитоплазмы, в связи с чем недостаточно чет ко маркируются хламидии Недостаточно четкая контрастность в связи с закрашиванием фона (цитоплазмы)Закрашиван ие фона (цитоплазмы) обусловливает малоудов- летворительную контрастностьЗначительное прокрашивание фона пре- допределяется недостаточно четкую контрастность выявляемых хламидий; трудно дифференцировать хла мидии от клеточ н ы х элементов и частиц краси-. теля