Способ определения концентрации микроорганизмов

Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик ОЛ ИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ п 1973610Опубликовано 15.11,82. Бюллетень 42Дата опубликования описания 15.11.82 по делаи изобретений и открытий(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВИзобретение относится к микробиологии, , в частности к способам определения концентрации микроорганизмов.Известен способ определения концентрации микроорганизмов, включающий регистрацию хемилюминесценции, возникающей 5 при разложении перекиси водорода ферментом каталаза в присутствии хемилюминесцент.ного состава 11Недостатком способа является его огра 1 О ниченная применимость, так как не все микроорганизмы содержат каталаэу.Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является способ определения концентрации15 микроорганизмов, предусматривающии при. готовление( суспензии микроорганизмов в водной среде, окисление клеточных структур марганцевокислым калием и регистрацию кинетики хемилюминесценции. Согласно этому способу к анализируемой суспензии микроорганизмов в дистиллированной воде добав. ляют раствор марганцевокислого калия, При окислении марганцевокислым калием белков 2клеточных оболочек бактерий возникает хемнлюминесценция, по кинетике которой можно различать живые и мертвые бактерии. Для мертвых микроорганизмов с момента введения окислителя интенсивность хемилюминесценции во время растет, достигает максимального значения и относительно медленно уменьшается. Для живых микроорганизмов интенсивность хемилюмннесценции возрастает, проходит через максимальное значение, уменьшается, затем снова возрастает, проходит через второе максималь ное значение и далее снова уменьшается,На фиг. 1 представлены кинетические хемилюмннесцентные кривые живых и меутвых микроорганизмов Сапд 1 да дЫегпюпой суспендированных в дистиллированной воде.Окислитель 0,1% КМп 04 + 1,8 М ВаСз.Концентрация Сапдда Яцегпюпд 2 10 кл,/ /проба. Стрелкой обозначено время ввода окислителя. Кривая 1 - Сапдда 90 егпюп - дй, убитые кипячением, кривая 2 - суспензия, содержащая 98% живых клеток. По осн ординат интенсивность хемилюминесцен973 б 10 45 50 55 3ции, отн. ед., масштаб кривой 1 составляет1:10 от масштаба 2, по оси абсцисс время, с.Интенсивность хемилюминесценции в обоих случаях прямо пропорциональна концентрации микроорганизмов,Для суспензий, содержащих одновременноживые и мертвые бактерии, интенсивностьпервого максимума Э меньше, чем длямертвых бактерий и выше, чем для живых,а интенсивность второго максимума 3,2 мень.ше, чем для живых, Отношение интенсив.,костей, Э /Э уменьшается с уменьшением относительйого содержания живых бактерий,т.е. величина Э 2 /31 характеризует относительное содержание живых бактерий ванализируемой суспензии, а значения Э 1 иЭ,2 - концентрацию микроорганизмов 21 .Недостатком способа является небольшая точность определения концентрации иотносительного содержания живых микроорганизмов, связанные с невысокой чувствительностью способа для живых бактерий посравнению с мертвыми, вследствие дестабилизации мембранных белков живых клеток вдистиллированной воде. Величина интенсивности второго максимума на кинетической кривой хемилюминесценции, зарегистрированнойдля живых микроорганизмов (фиг. 1, криввая 2), незначительно превышает величинуинтенсивности на кривой хемилюминесценции мертвых микроорганизмов при времени,соответствующем второму максимуму хемилюминесценции живых бактерий. Вследствиеэтого в диапазоне относительного содержания живых микроорганизмов от 0 до 50%концентрацию живых микроорганизмов практически невозможно определить.Целью изобретения является повышениеточности определения концентрации клетоки относительного содержания живых мйкро.организмов.Поставленная цель достигается тем, чтосогласно способу определения концентрациимикроорганизмов, предусматривающему приготовление суспензии микроорганйэмов вводной среде, окисление клеточных структурмарганцевокислым калием и регистрациюкинетики хемилюминесценции, перед окисле.нием клеточных структур добавляют в водную среду днгидрофосфат калия до достижения рН 4,0 - 4,7 и выдерживать в течение2-10 мин.Способ основан на стабилизации клеточных оболочек живых микроорганизмов иона.ми водорода и на смещении равновесиямежду окислитсльными состояниями марганца в сторону ионов трехвалентного марганца при помощи ионов водорода и фосфата,В резулыате взаимодействия мембран и кле 5 1 О 15 20 25 ЭО 35 40 4точных оболочек живых клеток с ионами водорода, образующимися при диссоциации дигидрофосфата калия, структурные единицы мембран увеличивают устойчивость, При взаимодействии марганцевокислого калия с жи. выми клетками второй максимум хемилю. минесценции обусловлен реакцией ионов марганца с реактивными белковыми группами, экспонированными внутрь клетки, Доступность реактивных групп зависит от скорости проникновения ионов марганца в клетку и от скорости разрушения оболочек клеток окислителем, происходящего одновременно с хемилюминесцентной реакцией. При стабилизации мембранных белков скорость разрушения клеточной оболочки марганцевокислым калием уменьшается, а количество неразрушенных клеток увеличивается. В результате этого к моменту появления второго максимума количество реагирующих с ионами марганца белковых групп больше, чем в случае нестабилиэированных мембран, что и приводит к увеличению интенсивности второго максимума хемилюминесцснтной кинетической кривой.Введение дигидрофосфата калия в контакт с марганцевокислым калием препятствует образованию двуокиси марганца, образующейся в нейтральной среде и выводящей ионы марганца из реакции. Вследствие этого увеличивается степень превращения перманганат-аниона в ионы трехвалентного марган. ца, участвующие в процессе излучения энер. гии. Увеличение концентрации ионов Мп вызывает увеличение скорости реакции окисления и, соответственно, скорости спада интенсивности хемилюминесценции мертвых микроорганизмов, что обеспечивает уменьшение отношения Э 2 /3 1 для мертвых бактерий по сравнению с нейтральной средой и увеличение различия значений Э 2 /3 живых и мертвых микроорганизмов. На фиг. 2 представлены зависимости интенсивности второго максимума хемилюминесценции Э 2 (кривая 1), отношения интенсивностей второго и первого максимумов 32 /3 (кривая 2) суспснзии Мсгосос - сца 9 цтапзсыа и интенсивности фонового свечения среды инкубацииф (кривая 3) от рН. Кислотность среды варьируют введением дигидрофосфата калия различной концентрации. Концентрация Мсгососсиз1 О кл./ /проба (95% живых клеток), время инкубации 10 мин, Условия окисления те же, что и на фиг. 1, По оси ординат 32, 32/Эи Э, в относительных единицах, по оси абсцисс рН среды инкубации. Интенсивность Л 2 при рН 7 принята за единицу.(3,2/Э - А) 100 Х С = К( 2- А 3) 5Из данных фиг, 2, видно, что введениедигидрофосфата калия до рН 4,7 - 4,0 в суспензию микроорганизмов приводит к увеличению интенсивности второго максимума хемилюминесценции 3 2 и отношения Э 2 Л,.Дальнейшее уменьшение рН, помимо увеличения интенсивностии отношения 3 2/3приводит к резкому возрастанию интенсйвности фонового свечения среды инкубации3 ф (кривая 3 на фиг, 2), что увеличива. 1 О.ет погрешность определения величин 3 и3,2 /3, В .таком случае оптимальными значениями рН среды инкубации являются 4,7 -4,0, при которых способ позволяет определять концентрацию микроорганизмов в диа- тэназоне относительного содержания живыхклеток от 20 до 100%,Время прединкубации суспензии микро.организмов с дигидрофосфатом калия должно составлять не менее 2 мин, поскольку, начиная с, этого момента, отношение интенсивностей 3 /3 становится максимальным и неменяется при увеличении времени прединкубации,На фиг. 3 представлена зависимость отнощения интенсивностей второго и первогомаксимума хемилюминесцентной кинетическойкривой 32 /3 суспенэии М 1 сгососсца д 1 итогп 11сна от времени инкубации с 0,05 М дигидрофосфатом калия (рН 4,63). Концентрация З 0М 1 сгососсов 1 10 кл,/проба (95% живыхклеток), Условия окисления те же, что нафиг. 1, По оси ординат 32/Э, по оси абс..цисс время инкубации, мин.Способ осуществляют следующим образом.зК 0,5 мл суспензии СапгЫа до 111 еггпопйдобавляют 0,5 мл 0,1 М дигидрофосфата калия (рН смеси 4,63) и выдерживают 2 минпри комнатной температуре, Отбирают 0,2 млв кварцевую кювету и помешают в кюветное 40отделение установки для регистрации кинетики хемилюминесценции. Вводят в кювету0,2 мл раствора окислителя (0,1% КМл 04 ++ 1,8 М ВаСг) и одновременно начинаютрегистрировать кинетику хемилюминесцентнойреакции. После проведения реакции по хемилюминесцентной кинетической кривой определяютзначения интенсивностей первого и второгомаксимумов ( Эи 3соответственно).Концентрацию живых микроорганизмов опре 30деляют по эмпирической формуле где С - концентрация живых микроорганизмов;ИА - значение отношения интенсивностей второго и первого максимумов хемилюминесценции313, определенбное для Сапйда дш 11 егпюпд 11, убитых кипячением (поскольку второймаксимум на кинетической кривоймертвых клеток отсутствует;в качестве Э используется значение интенсивности хемилюминесценции при временивторого максимума живых клеток,К определяется по калибровочной кривой,описывающей интенсивности суспензий с извест.ной концентрацией живых клеток.Относительное содержание живых клеток(х) определяют путем расчета отношениязарегистрированных интенсивностей второгои первОго максимумов хемилюминесценциипо эмпирической формуле следующего вида 2 / 1Х ------ 100%, (2 )1 /1 де А - определяется так же, как и в формуле (1);В, О - постоянные, рассчитанные экспериментально из опытов с использованием суспензий с известным относительным содержанием живых кле.ток после преобразования формулы(2) в линейное уравнение подставляя в уравнение (3) значения Э /Эдля двух суспензий с разным известным относительным содержанием живых клеток, определяют значения В и О.Для суспензии Сапг 1 га дц 1 1 еггпопд 11 при рН 4,63 значения А, В и Э,составляют 0,068, 0,0064 и 0,993 соответственно.Сравнивают результаты по измерению концентрации и относительного содержания живых клеток в суспензии СапЖда до 111 егпзопд 11 известным и предлагаемым способами, Контроль концентрации живых микроорганизмов осу. ществляют путем высова пробы на чашки Петри с питательной средой и подсчета выросших колоний. Относительное содержание жи. вых микроорганизмов измеряют путем под. счета общей концентрации клеток в камере Горяева с последующим делением числа жизнеспособных клеток на их общее количество. Результаты экспериментов приведены в таблице. Как видно из таблицы, при относительном содержании живых клеток менее 50%, когда известный способ не позволяет точно определять концентрацию и относительное содер. жанне живых микроорганизмов, введение в водную средудигидрофосфата калия обес973610 печивает определение относительного содержания живых клеток с точностью до 4%, а кон. центрации живых клеток с точностью до 10%. При относительном содержании живых микроорганизмов свыше 50% предлагаемый спо.5 соб дает точность для относительного содержания в 1,5 раза выше, чем известиыи способ, для концентрации живых микроорганизмов точность в 2,5 раза выше.Таким образом, использование предлагаемого ф способа определения концентрации микроорга. Известный Контрольспособ1,6 10 30,3 Концентрация живых микроорганизмов, кл/мл суспензии Предлагаемый способ30 0,2 2,5 108 49 25,0 45,7 1,0-10 а 5,2 109 5)1 109 79 86,3 80,8 89 91,2 88,3 98 97,1 97,4 Формула из о брет енияСпособ определения концентрации микроорганизмов, предусматривающий приготовле ние суспензии микроорганизмов Ь водной среде, окисление клеточных структур марган сцевокислым калием и регистрацию кинетикихемилюминесценции, о т л и ч а ю щ и й. с я тем, что, с целью повышения точности определения концентрации клеток и относи. тельного содержания живых микроорганйз. мов, перед окислением клеточных структур 1,6 10 8,1 10 1,610 ф .3,5109 6,8 1,510 а 92 10 а 1,8 10 а 3,2 10 ф 7,0 10 а ниэмов по сравнению с известными способамипозволяет в одном эксперименте одновременноопределять концентрацию и относительное содер.Ванне живых микроорганизмов вдиапазонеЬтносительного содержания от 20 до 100% сточностью определения относительного содержа.ния в диапазоне от 20 до 70% не выше 4%,а в диана оне от 70 до 100 не выше 1%, чтоособенно важно при контроле производственных процессов биосинтеза; анализе готовогопродукта и стандартизации музейных культур,Относительное содержание живых микроорганизмов, %Предлагаемый Известный Контроль способ способ в водную среду вводят дигидрофосфат калиядо достижения рН 4,0 - 4,7 и выдерживаютв течение 2 - 10 мин,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Авторское свидетельство СССР У 473744,кл. С 23 О 1/06, 1973,2. Лебедев В. С, Исследование структурныхпереходов в оболочке бактерий Е, Со хемилюминесцентным методом, Канд. дисс. М.,1977.973610 фи ГСоставитель В, Голимбетедактор И. Митровка Техред Е,Харитончик Корректор У. Пономаренк ПодписноССР д, 4/ Филиал ППП"Патент", г. У род, ул; Проектная,8617/29 Тираж 505 ВНИИПИ Государственного к по делам изобретений и о 113035, Москва, Ж - 35, Раушская