Способ определения концентрации живых микроорганизмов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ СПУБЛИК 19) Б(5114 С 12 Н 1/00 С 1 ю Ж ТЕНИЯ учко,микроом ци на кле- клетГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ САНИЕ ИЗО КОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИЖИВЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ(57) Изобретение относится к микробиологии, а именно к анализу деионизованной воды на содержание микроор ганизмов, и может быть использовано в электронной промышленности. Целью изобретения является повышение точности определения концентра иорганизмов. Способ основан тчто люминесцентный краситель не проникает в живую клетку из-за барьерных свойств клеточной мембраны. Придобавлении красителя к суспензииток он окрашивает только мертвые ки, число которых подсчитывают в качестве фона. Затем к суспензии добавляют органический растворитель, делающий мембрану проницаемой для красителя, при этом дополнительно окрашиваются живые клетки, а затем подсчитывают общее число живых и мертвыхклеток. Вычитая из второго результата первый, определяют число живых С,микроорганизмов. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.13069Изобретение относится к микробиологии, а именно к анализу деионизованной воды на содержание микроорганизмов, и может быть использовано в электронной промышленности.Цель изобретения является повышение точности определения концентрации микроорганизмов в деионизованнойводе.Способ определения концентрации 10 живых микроорганизмов заключается в определении разности между общим числом клеток и числом мертвых клеток, основанном на селективном окрашивании мертвых клеток Флуоресцирующим красителем, предусматривающим добавление к исследуемой суспензии клеток красителя, образующего с внутриклеточными компонентами флуоресцирующий комплекс, не способный проникать че рез неповрежденную клеточную мембрану, подсчете флуоресцирующих частиц, причем после указанного подсчета к суспензии клеток добавляют ор 25 ганический растворитель, нарушающии барьерные свойства мембраны клеток по отношению к флуоресцентному красителю и вновь подсчитывают число Флуоресцирующих частиц. Прирост их числа и результате добавления орга нического растворителя принимают за число жизнеспособных микроорганизмов,Способ основан на том, то люмилесцентный краситель не проникает в живую клетку иэ-за барьерных свойств клеточной мембраны. При добавлении красителя к суспвнзии клеток он окрашивает только мертвые клетки, число которых подсчитывают в качестве. фона. 40 Затем к суспензии добавляют органический растворитель, делающий мембрану проницаемой для красителя, при этом дополнительно окрашиваются живые клетки, а затем подсчитывают общее 45 число живых и мертвых. Вычитая из второго результата первый, определяют число живых микроорганизмов.Таким образом, при подсчете определяется фон: число мертвых микроорганизмов и частиц, обладающих по какой-либо причине собственйой характерной люминесценцией. При втором подсчете к ним добавляется число живых микроорганизмов, прокрасившихся элагодаря добавлению вещества, дей"твующего, на мембрану. Вычитая первый "чет из второго, вычитают фон, Это 47Уобстоятельство повышает чувствительность и точность способа.Известно1, что мембраны живых клеток непроницаемы для большинства цитологических красителей, Поэтому в большинстве цитологических методик окрашиванию предшествует операция фиксации, заключающаяся в обработке клеток кислотами и спиртами. Такаяобработка разрушает мембрану и краситель окрашивает внутриклеточные компоненты. Фиксацию для рассматриваемой цели проводить нецелесообразно, так как, кроме тогс, что добавляется ряд операций, все клетки посл фиксации оказываются мертвыми и зопрос об определении живых не стоит. Окрасить клетки можно и непосредственнов анализируемом растворе, сделав мембрану проницаемой для красителя, Такой способ и вещества известны в лабораторной практике: для сохранениярастворов от "зарастания" к ним обычно добавляют каплю толуола или хлороФорма, микроорганизмы при этом погибают именно из-за повреждения данными растворителями мембран,Для окрашивания клеток испытали указанные вещества, Окрашивание происходит, однако следы толуола и хлороформа вызывают значительное тушение люминесценции для ликвидации которого прооу нужно дополнительнонагреть, чтобы испарить эти вещества.Поэтому хотя применение толуола и хлороформа для окрашивания возможно,но неудобно. Бенэол не вызывает тушения люминесценции, поэтому он удобней. Сделать мембрану проницаемой дпя красителя можно, добавив к пробе примерно 10 М этилендиамин-тетрааэетата(ЭДТА), который связывает ионы кальция и магния и тем самым разрушает структуру мембранных белков. П р и м е р 1, Пробы деиониэованной воды объемом 100 мл отбирают вразных точках технологических становок: пробы 1-3 после фильтров "онкойочистки, проба 4 до фильтра, причемпосле промывки установки 37-ной перекисью водорода с целью стерилизации. К каждой пробе добавляют по 0,1 мл водного раствора этидиум бромида (0,2 мг/мл). Каждую пробу разделяют пополам, к вторым половинам добавляют по 1-2 капли бензола, тщательновстряхивают и оставляют обе половиныстоять 1 ч. Пробы фильтруют через мембранные фильтры для люминесцентной микроскопии. Сканируя фильтр под люминесцентным микроскопом в красной области, подсчитывают число флуоресцирующих частиц. Каждую частицу иденти фицируют визуально по морфологическим признакам, при необходимости переходя на большее увеличение. Концентрацию частиц подсчитывают по формуле1 г 1 1 ОС=- 24 Р,где К - подсчитанное число частиц;- 100 мм - длин;. сканирования;Р, = 1,б мм (об.х 10) - диаметрполя зрения объектива;с = 17 мм - диаметр зоны фильтрации на фильтре;Ч = 50 мп - объем пробы.После подстановки указанных значений формула для определения концентрации приобретает видС = 0,028 Ы.Поскольку источником погрешностиопределения является малость числа Ии то, что измерение проводят один раз,само число определяют со средней квадратичной погрешностью + Г 2 . Поэтому погрешность определения концентрации микроорганизмов следующая:С=ф 0,028-Б,Б таблице даны примеры подсчетапо видам микроорганизмов, их концент 35рации в первой (С) и второй пробах (С ) и концентрации живых микро 2огранизмов (С -С). Зависимость, представленная в формуле определения концентрации флуоресцирующих частиц, выведена впервые,носит частный характер - подсчет частиц на фильтре под микроскопом - икасается конкретного примера осуществления предлагаемого способа, кроме того, она очевидна,где п - плотность расположения частиц на фильтре; площадь фильтрации;диаметр зоны фильтрации. где И - число сосчитанных частиц; Б - площадь сканирования. Ис 1 Таким образом С=8 4 Чг) 8=1 Р,где , - длина сканирования;Р, - диаметр поля зрения объектива.ИЯ 1Таким образом,С= 1,. РЧДля сравнения чувствительности и точности прототипа и предлагаемого способа рассматривают анализ деионизованной воды, загрязнения в которой установлены другими независимыми способами.Деионизованная вода высшей очистки марки "А" содержит, млЧастицы (сч) ) 0,5 мкм До 300Живые микроорганизмы(М и/о) Примерно 1Флуоресцируюшие частицы (фч) 0,5Определение по известному способу.1-й подсчет Ж м/о+М м/о + сч=1+1+ +300=302 мл11-й подсчет М м/о+фч=1+0,5= =1,5 мл1-11=302-1,5 = 300 млт.е. для принятых условий погрешность определения составляет(300 1) 100 - 30 0071оОпределение по предлагаемому способу.1-й подсчет М м/о+фч=1+0,5= =1,5 мл .11-подсчет Ж м/о+М л/о+фч=2,5 мл 11-1=2,5-1,5=1 млЭтот анализ сделан без учета статистических погрешностей, Реальные погрешности для определений по предлагаемому способу приведены в таблице. Формула изобретения 1, Способ определения концентрации живых микроорганизмов, предусматривающий добавление к суспензии микроорганизмов красителя, образующего с внутриклеточными компонентами флуоресцирующий комплекс, не способный про(С,-С, )+3 о.о Грибы О.О 6 Дрожжи 0.1 0.2 Бактерии 20 0.6 70 2.0 0.0 Кокки О.з Флуоресцирующиечастицы О.з 32 Всего: 2,8+0.3 1.9+0.4 Грибы 0.1 0.0 Дрожжи 0.2 Бактерии 0,8 120 0,3 12 Кокки 0,3 Флуоресцирующиечастицы 0,0 0.03 Всего: 39 3 7+0.3 2,6+0.4 3 Грибы 008 Дрожжи 06 Бактерии 1.0 70 2.0 Кокки 0,0 0,0 0.0 Флуоресцирующиечастицы 10 0.3 6 1,7+0.2 99 0.2 Всего: 2,8+0,3 1.1+0,4 4 Грибы 20 26 186 170 Дрожжи 635 Бактерии 686 никать в клетку через неповрежденную мембрану, подсчет окрашенных частиц, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности определения микроорганизмов в деионизованной воде, после подсчета окрашенных частиц к суспензии клеток добавляют органический растворитель, вновь подсчиПроба, Вид микроорганизма И М тывают число окрашенных частиц, а концентрацию живых микроорганизмов определяют по разности между вторым и первым подсчетами,2, Способ по п, 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве органического растворителя используют бензол или толуол, или хлороформ. 0,2 10 0.9 ф 0,2 99 0.0 4 1,1+0.2 133 0.03 3 0.4 20140 161 Кокки Флуоресцирующиечастицы 54 48 1035 2+0.9 1091 Всего: 3+ О. 9 1+ 1. 3 Составитель Л.БорисоваРедактор М.Бандура Техред А.Кравчук Корректор М,Демчик Заказ 1497/23 Тираж 500 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5