Способ качественного и количественного определения циклических нуклеотидов

1655343 Ооюз Советских оциалистически Республик(1)МК6 01 Т 1/1 аявлено 07,04.76 (21) 2343057/2 32) 08.04.75 3) Приорит 1) 14462/75 Государственный комитет СССР Ро делам иэобретений и открытийюллетень М ано 30,03.7 43) Опублик 45) Дата оп икования описания 30.03,79 72) Авторы изобретени Иностранцы еджинальд Монкс и Идрис Лью(Великобритания) Иностранная фирма Дзе Радиокемикал Сентр ЛимТо 1) Заявите те 4) СПОСОБ КАЧЕСТВЕННОГО И КОЛИЧЕСТВЕННО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИКЛИЧЕСКИХ НУКЛЕОТИДОВИзобретение относится к области аналитической химии, а именно к способам качественного и количественного определения нуклеотидов.Известен способ качественного и количе ственного определения циклических нуклеотидов в биологической жидкости, основанный на обработке определяемого циклического нуклеотида меченым специфическим к каждому нуклеотиду реагентом, выделе нии продукта реакции и определении количества связанного меченого реагента, причем в качестве меченого реагента используют нуклеотид, меченный фосфором 32 и углеродом 14 11. 15Недостатком этого метода является малый период полураспада фосфора 32 (14,3 суток) и низкая радиоактивность углерода 14.Известен способ качественного и количе ственного определения циклических нуклеотидов в биологической жидкости, основанный на обработке определяемого циклического нуклеотида меченым реагентом, выделении продукта реакции и определении количества связанного меченого реагента, причем в качестве меченого реагента используют нуклеотид, меченный тритием 2).Недостатком этого метода является его длительность и сложность, так как тритий является источником бета-излучения. Целью предлагаемого изобретения является сокращение времени анализа и упрощение способа. Поставленная цель достигается описываемым способом качественного и количественного определения циклических нуклеотидов в биологической жидкости, основанным на обработке определяемого циклического нуклеотида меченого селеном, специфическим к каждому нуклеотиду реагентом, выделении продукта реакции и определении количества связанного меченого реагента.Отличительным признаком способа является использование в качестве меченого специфического реагента реагента, меченого селеном,Эти меченые селеномпроизводные делятся на два класса:1) в которых пуриновое или пиримидиновое ядро замещено группами, содержащими селени2) в которых 2-о-гемисукцинат циклического нуклеотида сочетается с амином или аминокислотой, содержащей селен.Продукты, относящиеся к первому классу, могут быть получены путем замены атома галоида (обычно атома хлора или брома) в галоидзамещенных циклических нуклеотидах ионом селеноводорода. Образующийся при этом селенол может быть алкилирован при помощи иодистого алкила для/о - сн о во=р он бн нбн 25 носн, в 5 ц-СН Ок но:р-он "зкА 3 Нттб-.;,/М3,н ю (Э ф",1 б 3=ЯеСН,;б 5 К 4= - ОН; получения алкилселенопроизводного. Реакции могут быть выполнены в водной среде, Можно также пользоваться другими вытесняющими нуклеофилами, такими как селеномочевина. Полученные таким образом соединения потенциально пригодны в качестве радиоактивных лигандов при определении аденозин,5-циклического монофосфата (АМФ).Продукты, относящиеся ко второму клас су, могут быть получены при взаимодействии между селенметил-.-селеноцистеином - селеноми 2-о-гемисукцинатом циклического нуклеотида в среде диметилформамнда в присутствии И-этоксикарбо нил-этоксидигидрохинолина (ЕЕВИЧ) . Эти продукты с сопряженными связями приготовлены из 3,5-циклического АМФ и 3,5- циклического бМР и показано их прочное связывание с антителами для этих цикли ческих нуклеотидов (1 Ч и Ч) 43. К,= - ЬеСНз, йг= - Н; Яз= - Н; й==- - ОН;4. й,=- - ХН,; й,:= - Н; й,= - Н;Й 4 ОСО СНСНСО ХНСНХМ(СООН)СН,ЯеСН,;5, й, -- ОН; В=-На Кз= - Н;Я 4 ОСО СИрСНСО ХНСН(СООН)СНрХЯеСН,.Изобретение позволяет использовать селендля мечения циклических нуклеотидов вообще и в частности следующихгрупп, из которых 1, 11 и 111 имеют наиболсе важное значение.1, А,В Аденозин,5-циклический фосфат (циклический АМФ), замещенный вположении 6, или 8, или 2. Например:8-метилселеноциклический АМФ, полученный из 8-бромциклического АМФ и метилселенида натрия;6 - метилселенопуринрибозидциклическийфосфат, полученный из 6-хлорпуринрибозидциклического фосфата и метилселеноцистеамина,П, А,В,. Цистидин,5-циклический фосфат, замещенный в положении 2, или 4,или 2,111. А 1 В,. Гуанозин,5-циклический фосфат (циклический СМФ), замещенный вположении 2, 6, или 8, или 2, Например:8-метилселеноциклический ОМФ, полученный из 8-бромциклического СМФ и селеномочевины;2-метилселеноинозин - 3,5 - циклическийфосфат (циклический ЗМР), полученный из2-хлорциклического ЯМР и метилселениданатрия;2-амино- метилселенопуринрибозидциклический фосфат, полученный из 2-амино 6-хлорпуринрибозидциклического фосфатаи метилселенида натрия;Иг- (2 - метилселеноэтил) - циклическийСМР, полученный из 2-хлорциклическогоЗМР и метилселеноцистемина.1 Ч, А,В 4. Уридин,5-циклический фосфат, замещенный в положении 2, или 4,или 2.Ъ. А,В. Тимидин,5-циклический фосфат, замещенный в положении 2 или 4.Й АВ,. Инозин,5-циклический фосфат (циклический 1 МФ, замещенный в положении 2, 6, 8 или 2,В этих примерах, заместителями у пуринового или пиримидинового кольца являются либо селено-(С, - С 4) -алкильные или(С 1 - С 4) - алкилселено - (С 1 - С 4) - алкиламиногруппы; заместители у кольца рибозыописываются формулой- ОСО СНг СНг СОИН КЯейг,где Й 1 представляет собой алкиленовыегруппы С 1 - С 4, которые могут нести насебе группу - СООН, аЯг представляет собой алкильную группуСАтомы селена содержат искусственно созданную высокую долю селена 75,Получение 8-метилселеноаденозин - 3,5 циклического монофосфата - селена.Водный раствор кислого селенида натрия - селенаготовят путем прибавления воды (1 мл) к смеси красного селена - селена(0,011 м атом; 300 мкюри;27 кюри/м атом) и боргидрида натрия(1,6 мг; 0,042 ммоль).Смесь перемешивают при комнатной температуре в атмосфере азота до тех пор, пока весь селен не растворится. Избыток боргидрида натрия разрушают путем нагревания раствора в течение 5 мин при 100 С.К раствору кислого селенида натрия - селенаприбавляют 8-бромаденозин,5 циклический монофосфат (5,2 мг;0,013 ммоль) в воде (1 мл) и смесь перемешивают в течение 3,5 ч при 90 - 95 С,Реакционную смесь обрабатывают иодистым метилом (0,5 мл), дитиотрентолом(5 мг) и карбонатом натрия (10 мг) и перемешивают при комнатной температуре втечение 2 ч. После этого смесь упариваютпри пониженном давлении до небольшогообъема, целевой продукт выделяют и очищают методом препаративной тонкослойной хроматографии в двух системах:1) 1 мм силикагель (Мерк 60 РР 2 з 4)н-бутанол, уксусная кислота, вода (60:15::25) и 2) 1 мм целлюлоза (Авицель) и-бутанол, уксусная кислота, вода (60:15:25).более быстро перемешаюшийся компонентс двумя радиоактивными полосами поглощения в ультрафиолетовой области спектрав системе 1 подвергнут повторному хроматографированию в системе 2, После авторадиографии пластинки медленнее перемешаюшийся из двух компонентов, полученный в системе 2, экстрагирован водой дляполучения 11 мкюри 8-метилселеноаденозин,5-циклического монофосфата - селена.Ь 1 акс. 287 им (емакс. 1 6300) . Идентичность продукта подтверждена сравнением счистым, нерадиоактивным 8-метилселеноциклическим АМР в шести хроматографических системах.Получение 8 -метилселеногуанозин,5 циклического монофосфата - селена,Водный раствор кислого селенида натрия - селенаготовят путем прибавления воды (1 мл) к смеси красного селена(0,016 м атом; 421 мкюри; 26,2 мкюри/матом) и боргидрида натрия (1,5 мг;0,039 ммоль). Смесь перемешивают прикомнатной температуре в атмосфере азотадо полного растворения селена, Иодид5-метилизотиоурония (3,8 мг; 0,017 ммоль)в воде (0,5 мл) продувают азотом и прибавляют к раствору кислого селенида натрия - селена, Реакционную смесь нагревают в течение 2 ч прп 90 С. Анализ реакционной смеси по прошествии этого перио 510 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 да времени указал на наличие одного радиоактивного компонента с величиной Ь 0,60, дополняюшего красный селен - селен. Раствор лиофилизируют и остаток экстрагируют ацетоном (2 мл). Раствор в ацетоне выпаривают досуха для получения селеномочевины - селена(157 мкюри;6,0 Х 10 -ммоль), которую хранят в твердом состоянии при температуре - 140 С до момента ее использования.К селеномочевине - селену(6,0 ХХ 10 -ммоль) прибавляют 8-бромгуанозин,5-циклический монофосфат (свободная кислота; 3,2 мг: 7,5 Х 10ммоль) в безводном метаноле (1 мл) и смесь нагревают при температуре кипения с обратным холодильником в течение 8 мин, затем охлаждают. К реакционной смеси поочередно прибавляют метилат натрия (1,2 мг) в метаноле (220 мкл) и иодистый метил (10 мкл) в метаноле (250 мкл), реакционную смесь перемешивают в течение 3 ч при комнатной температуре. Раствор выпаривают досуха и остаток очищают методом тонкослойной хроматографии с применением системы из 1 мм целлюлозы авицель на пластинке (94 /о -ный водный бутанол, 44 о/о-ная водная пропионовая кислота, 1:1). Главный радиоактивный компонент после определения его местоположения удаляют с пластипки и экстрагируют водой. Продукт (8,8 мкюри) хранят при температуре - 140 С. Установлено, что радиохимическая степень его чистоты составляет 96/о,о но он содержит не радиоактивные примеси, поглощающие в ультра-фиолетовой области спектра. Часть продукта (0,3 мкюри) помещают в колонку сефадокса (20 Х 1 см) и элюируют 0,1 М раствором бикарбоната аммония. Главную радиоактивную фракцию, не содержащую нерадиоактивных примесей, поглошающих в ультрафиолетовой области спектра, собирают и выпаривают досуха.После выпаривания с водой для удаления бикарбоната аммония получают 8-метилселеногуанозин,5- циклический монофосфат - селен(0,22 мкюри). Этот продукт связывает антитела, возникающие против циклического 6 МФ-сукцинил-ВЯА.Сочетание 2-О - сукцпнилгуанозин - 3,5- циклического монофосфата н селенометил.-селеноцистсина - селена.Раствор 2-О-сукцинилциклического бМФ (0,45 мг; 1,0 ммоль) и 1-этоксикарбонил- этоксидцгидрохинолина (0.7 мг) в безводном диметилформамиде (75 мкл) прибавляют к раствору селенометил,-селеноцистеина - селена(16,1 мкюри); 1 ммоль) и триэтиламина (5 мкл) в диметилформамиде (100 мкл). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре, Методом тонкослойной хроматографии с использованием системы целлюлозы авицель (н-бутанол, уксусная кислота, вода 60:15;.:25) установлено присутствие двух основных радиоактивных компонентов: селенометил,-селеноцистеина - селенас величиной К 0,63, а метилселеноцистеинового селен-производного с сопряженными связями 2-О-сукцинилциклического 6 МФ с величиной К 0,40. Продукт конденсации Йг 0,40) выделен методом препаративной тонкослойной хроматографии с применением целлюлозы авицель и указанной выше системы элюентов, Получен продукт с активностью 0,7 мкюри.Получение диселенида - селена: бис 6,6-(пуринрибозид,5-циклического монофосфата).Раствор 6 - хлорпуринрибозид,5-циклического монофосфата (5,0 мг; 0,012 ммоль) и кислого селенида натрия - селена(0,06 ммоль) в воде (2 мл) нагревают в атмосфере азота в течение 2 ч. Реакционную смесь вносят в колонку сефадекса ДЕЛЕ (15 Х 1 см) и элюируют 0,1 М раствором дикарбоната аммония (500 мл), 0,2 М (500 мл) и наконец 0,3 М раствором бикарбоната аммония (500 мл). Главную фракцию, обладающую радиоактивностью и поглощающую в ультрафиолетовой области спектра, собирают и выпаривают досуха.При повторных выпариваниях с водой удаляют остаточный бикарбонат аммония.Продукт, представляющий собой диселенид - селенбис,6-(пуринрибозид,5- циклического монофосфата) дает спектр поглощения в ультрафиолетовой области с Хмак, 287 нм. После восстановления диселенида при помощи дитиотрентола (10 мг) в 1 М буферном растворе трис с величиной рН 7,5 (5 мл) изменения в спектре поглощения в ультрафиолетовой области указывают на характеристическое поглощение 6-селенопурина с 1 макс. 345 нм.Получение 6-метилселенопуринрибозид,5-циклического монофосфата - селена.Иодистый метил (0,15 мл) и дитиотретиол (12 мг) прибавляют к раствору диселенида - селена - 75 бис - 6,6-(пуринрибозид - 3,5 - циклического монофосфата) (3,7 мкмоль; 20 мккюри) в 1 М буферном растворе трис с величиной рН 7,5 (5 мл), смесь тщательно перемешивают в течение 1 ч. Раствор вносят в колонку сефадекса ДЕАЕ (15 Х 2 см) и после этого колонку элюируют 0,2 М раствором бикарбоната аммония. Главную фракцию, поглощающую в ультрафиолетовой области спектра и обладающую радиоактивностью, собирают и выпаривают досуха; повторные выпаривания с водой служат для удаления остаточного бикарбоната аммония, Выход 6-метилселенопуринрибозид,5 - циклического монофосфата - селенасоответствует27 мккюри.Хм,.н, 231 мм, 304 нм (рН 7). Один компонент обнаружен методом хроматографии0 1 4 8 16 П р и м е р 2. Типовая характеристика чувствительности к дозе излучения при определении циклического 6 МФ с применением 8-метилселеногуанозин,5 - циклического монофосфата-Яе 75.Стандартные растворы циклического ОМФ, содержащие 0,25; 0,5; 1,0; 2; 4; 8 и 1600 пикомоль в 100 мкл буферного раствора на 50 ммоль трис/ЕДТА (4 ммоль) с рН 7,5 вносят пипеткой в пробирки, выдерживавшиеся при 2 - 4 С, концентрация в 16000 пикомоль на 100 мкл использована для определсния неспецифической связи. В пробирку вносят также 100 мкл буферного раствора для определения отсчета для ну. левой дозы. В каждую пробирку прибавля. на целлюлозе РЕ 1 с 0,2 М раствором бикарбоната аммония.П р и м е р 1. Типовая характеристика чувствительности к дозе излучения при определении циклического АМР с применением 8-метилселеноаденозин - 3,5-циклического монофосфата - селена.Стандартные растворы циклического АМФ, содержащие 1, 2, 4 и 8 пикомоль в 50 ммоль буферного раствора трис/ЭДТА, (4 ммоль), рН 7,5 (50 мкл) вносят пипеткой в пробирки при 2 - -4 С. Буферный раствор вносят также в пробирки с общей дозой, контрольной дозой и нулевой дозой соответственно, 150, 150 и 50 мкл, также при 2 - 4 С. В каькдую пробирку прибавляют 8-метилселеноциклический АМФ - сслен(3 пикомоль); удельная активность около 22 кюри/ммоль в 50 мкл буферного раствора.Во все пробирки, за исключением контрольных вносят связывающий белок (экстракт из мышц быка) в 100 мкл буферного раствора. Содержимое пробирок смешивают вращательным движением в течение примерно 5 с, а затем их выдерживают в тсчение 3 ч при 2 - 4 С. Во все пробирки, за исключением общей дозы вводят суспензию древесного угля в воде (100 мкл) и после перемешивания вращательным движением в течение примерно 5 е содержимое пробирок немедленно центрифугируют для осаждения древесного угля. Из верхнего прозрачного слоя каждой пробирки отбирают пробы по 200 мкл, как и из пробирки с общей дозой и отсчитывают на гамма- счетчике.Результаты представлены ниже.10 15 20 25 0 0,25 0,5 1,0 2,0 4,0 8,0 30 35 ют 8-метилселеноциклический бМФ - селен(0,25 пикомоль, удельная активность около 24 кюри/ммоль) в 50 мкл буферного раствора. Антитело сыворотки (против циклического бМФ-сукцинил- В 5 А) в 50 мкл буферного раствора вводят после этого во все пробирки. Содержимое пробирок быстро перемешивают вращательным движением и выдерживают в течение 3 ч при 2 - 4 С. Во все пробирки прибавляют по 1 мл водного раствооа сульфата аммония (насьпценного на 60%) при 2 - 4 С и пробирки после перемешивания их содержимого выдерживают в течение 5 мин при 2 - 4 С и затем центрифугируют. После декантирования верхнего прозрачного слоя жидкости и удаления приставшей жидкости осадки используют для проведения отсчета н а га м м а-счетчике. Дл я получения отсчета для общей дозы пользуются 0,25 пикомоль 8 - метилселеноциклического - 6 МФ - селена(удельная активность около 24 кюри/ммоль в 50 мкл буферного раствора).Полученные результаты приведены ниже.Связанный Доза циклического ОМф,мечен ы й с ел еном, 0045,333,7 27,8 22,3 14,0 9,3 6,5 П р и м е р 3. Типовая характеристика чувствительности к дозе излучения при определении циклического бМФ с применением селенометил-Ь-селеноцистеинового - селен-производного с сопряженными двойными связями 2-О-сукцинилциклического бМР.Стандартные растворы, циклического бМФ, содержащие 5, 10, 24, 40, 80 и 16000 пикомоль в 100 мкл буферного раствора из 50 ммоль трис/ЭДТА (4 ммоль) с величиной рН 7,5, вносят пипеткой в пробирки, выдерживавшиеся при 2 - 4 С. Концентрация в 16000 пикомоль на 100 мкл использована для определения неспецифической связи. В одну из пробирок вносят 100 мкл буферного раствора для определения отсчета, соответствующего нулевой дозе. В каждую пробирку вносят селенометил-Е - селеноцистеинового - селен-производного с сопряженными двойными связями 2-О - сукцинилциклического бМФ (0,59 пикомоль, удельная активность около 16,1 кюри/ммоль) в 50 мкл буферного раствора, Антитело сыворотки (против циклического СзМФ 2-сукцинил-ВЬА) в 50 мкл буферного раствора вводили во все пробирки. Содержимое пробирок быстро перемешивают вращательным движением и выдер 40 45 50 55 60 65 живают в течение 3 ч при 2 - 4 С, Во все пробирки вводят по 1 мл водного раствора сульфата аммония (насыщенного на 60%) при 2 - 4 С и после перемешивания, пробирки выдерживают в течение 5 мин при 2 - 4 С и содержимое центрифугируют.После декантации верхнего прозрачного слоя жидкости и з даления приставшей жидкости осадки используют для проведения отсчета для общей дозы используют 0,5 пикомоль селенометил-,-селеноцистенового производного с сопряженными двойными связями 2-О-сукцинилциклического 6 МФ в 50 мкл буферного раствора.Полученные результаты аналогичны приведенным в примере 2 и представлены ниже.Связанный Доза циклического ОМФ, циклнческ й ОМР,пикомольмеченый селевом, 040 24,55 17,3 10 16,7 20 11,8 40 8,3 80 6,1 П р и м е р 4. Оценка 6-метилселенопуринрибозид,5 - циклического монофосфата - селенапри использовании его в качестве радиоактивного лиганда при анализе насыщенности циклического АМФ,Вследствие низкой удельной активности б-метилселенопуринрибозид - 3,5-циклического монофосфата - селена, его способность к образованию связи исследована путем применения соединения селенав качестве конкурирующего ингибитора при связывании тритиированного циклического АМФ со связывающим белком.6-Метилселенопуринрибозид - 3,5-циклической монофосфат - селен(удельная активность 6,65 мкюри/ммоль) растворяют в буферном растворе тряс/ЭДТА для полу чения растворов с концентрацией 1156 пикомоль, 105 пикомоль и 9,6 пико- моль в аликвотной пробе 50 мкл. При нормальном испытании 100 мкл связывающего белка выдерживают вместе с тритиированным циклическим АМФ (0,9 пикомоль) и немеченым циклическим АМР (стандартные и испытуемые растворы). Связанный и свободный меченый циклический АМФ разделяют путем поглощения свободного циклического АМФ на древесном угле и активность связанного вещества определяют путем проведения отсчета для пробы верхнего прозрачного раствора. Для определения активности селенового аналога сначала определяют связывание при нулевой дозе, т. е. процент трптиированного циклического АМФ, связываемого без немеченого циклического АМФ или селенового аналога. Эту величину затем сравнивают со свя655343 12 Формула изобретения Связанный меченый тритиемциклический АМФ, оо Эквивалент циклического АМФ 20Селеновый аналог, пикомоль/50 мкл 01,1561059,6 54,5 0,42 0,96 5,06 0 161 69,7 12,2 25 Составитель В. Гладков Техред Н. Строганова Редактор Л. Герасимова Корректор Л, Орлова Заказ 312/19 Изд. Мз 231 Тираж 705 Подписное НПО Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Типография, пр. Сапунова. 2 зыванием тритиированного циклического АМФ в присутствии четырех различных доз селенового аналога. На основании полученных результатов можно вычислить количества немеченого циклического АМФ, кото рые вызвали бы снижение степени связывания, равное тому, которое вызывается селе- новым аналогом.Результаты, приведенные в таблице, показывают, что 9,6 пикомоль 6-метилселено пуринрибозид,5 - циклического монофоафата вызывают такое же вытеснение тритиированного циклического АМФ, как и 12,2 пикомоль циклического АМФ, т, е., что при применяемых концентрациях оба 15 эти соединения обладают весьма сходной способностью к связыванию. Способ качественного и количественного определения циклических нуклеотидов, основанный на обработке определяемого циклического нуклеотида меченым специфическим к каждому нуклеотиду реагентом, выделении продукта реакции и определении количества связанного меченого реагента, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и сокращения времени анализа, в качестве меченого специфического реагента используют реагент, меченный селеном. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. КоЬадазЫ К., Рапд Ч. Я., А затр 1 е апд сотреШке рго 1 еьп - Ь 1 пйпд аззау аког сус 11 с СтМР, ВосЬеписа 1 апд В 1 орЬуз 1 са 1 КезеагсЬ Сопппцп 1 са 11 опз, Уо 1., 67, 1975, р,р. 493 - 500.2. Ыпап А. б. А рго 1 е 1 п Ь 1 пйпд аввау аког адепоз 1 пе 35-сус 11 с топорЬозрйа 1 е, Ргоспс 11 пдз о 1 йе 1 ча 11 опа 1 Асайегпу о зе 1 епсез, ЮА, Чо 1. 67, 1970, р.р, 305 - 312,