Способ получения протеиносодержашего вещества

ОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ИЯ Союз Советских Социалистических Республик(33) Великобритания Гасударственный комнтет Совета Министров СССР оо делам нзооретеннй н открытий(45) Дата опубликования описания 23087 Иностранцы альд Лионель Соломонз н ДжАвторыизобретения льд Уильям мел иная фирмаак-Доугалл тсобритания) Иност Рэнк Ховис) Заявит ед Б ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕИНСОДЕРЖАЩЕ ВЕЩЕСТВА 54) а используют бно. нкробиологии, аотеннсодержащнхтеинов действием В качестве стимуляторови холин. коэффициенте разо равном 0,1 час, ествляют следуюосуществляют приеды, предпочтительаемый способ осущ Спосо авления Предл щим обраство получают путеммов, например грибка ательной, среде, содер щие рост питательныевиде способного асужит лимитирующим ции, и выделения поли. субстрат расмер крахмал,продукты их розу илн про- ерсированный уют штамм ВсЪпаЬе, гическом инстатунаций за Н 1 М 1 олизованньтй тапнока,тратаИзобретение относится к мименно к способам получения првеществ, например грибных промикроорганизмов.Известен способ получения протеинсодержащего вещества путем выращивания грибов рода Рцеагцв в аэробных условиях в водной пнтатель. ной среде, содержащей источник углерода в виде углевода, источник азота, минеральттые соли и сти. муляторы роста, с последующим выделением полученного продукта иэ культуральной жидкости.Цель изобретения - получение продукта высокого качества.Для этого при предлагаемом способе получение протеинсодержащего вещества из родаЕцвагцгп ис. пользуют вид агап пеагцпт.гтэ вида дгат пеагцв испольэдепонированньтй в Миколоте Британского содружества45425.Кроме того, из вида Дгатюеагцгп используют щтаммы за Р 1 М 1 154209, 1 М 1 154211, 1 М 1 154212, 1 М 1 154213, 1 М 1 154210.При этом выращивание проводят Ври рН преимущественно равном 3,5 - 7. Протеинсодержащее вещевыращивания микроорганизрода Рцвапцт, в водной пит1 О жащей основные стимулируювещества, углерод которых всимилироваться углевода слсубстратом при пролифераферированного организма.1 На стадии инкубации используюттительного происхождения, наприкрахмалсодержащие вещества илигндролиза, вещества содержащие сахадукты ее гидролиза, например, инв2 п сахар, или их смеси.Субстрат может содержать гидркрахмал картофеля, мелассы бобовых илиглюкозу. Возможно также использование субсживотного происхожденияф . Уз вода Ецоапцпт используют вид ттгае пеагцлт3Из вида ргае веагцв используют штамм 8 сЬеаЬв,депонированньй в Микологическом институте британского содружества за У 1 М 1 145425, его варианты и мутанты,Кроме того, из вида дгапцпеагцв используютштаммы за Мф 1 М 1 154209, 1 М 1 154211, 1 М 1154212, 1 М 1 154213, 1 М 1 154210.Втамм Ецаапца цгапипеагцпт Швабе 1 М 1 145425непатогенен относительно пшеницы и обладает следующими морфологическими свойствами, 19Среда. Картофельньй агар с сахарозой Чапек - Докс (модифицированный агар-оксоицц), 250 гкартофеля промывают, нарезают мелкими кусками, помещают в пресс-варильник на 15 мин поддавлением 10 3411 104 н/м. Отвар фильтруют через два слоя муслина. В мутный фильтрат добавля.ют 2% глюкозы и 2% агара, после чего средуавтоклавируют и диспергируют.Условия роста. Несколько недель при 25 С,Скорость роста 4,0 см за 3 дня, З,О см - за 3 дня. 20Характер роста. Хлопьевидные, распространенные колонии с белым воздушным мицелием. Субстрат на картофельном агаре с сахароэой - серовато-розовый с кусочками от малинового дожелтого. Тенденция к соломенно-желтому цве- Мту на агаре Чапека-Докса. Иногда образуется темно.красньй пигмент (в особенности при старении),После одной-двух недель воздушный мицелийсклонен к окрашиванию в бурый (коричневьй)цвет и сплющиванию. Колонии становятся слизис. 30тыми при образовании спородохий и цветом отрозового до коричневого на КСА (картофельномагаре с сахарозой) и оранжево. розовыми на ЧДА(агаре Чапек;Докса) .Эксудат не образуется, а образование пигмента 85соответствует окрашиванию мицелия.Конидии. Микроорганизмы не образуют микро.конидий, Микроконидии образуются иэ отдельныхбоковых стеригм или разветвленных конидиофор скороткими стеригмами. В старых культурах конидиофоры агрегируются с образованием спородохия(в особенности на ЧДА). Конидиц различны: отсерповидных до изогнутых дорзо-вентральныхперегородок от 3 до 5, в более молодых культурахобычно до 5, 45Размеры спор колеблются от 25-50 х 2,5 до4,0 мкм.Опорная клетка часто снабжена ножкой (вособенности у длинных с 5 перегородками спор)Вмицелии присутствуют разбухшие клетки и иногда 50включены хламидоспоры, отдельные или цепочки.Далее приводится пример получения вариантов(или изолятов) штамма Ецзагцв ДгапзееагцеШвабе 1 М 1 145425 и их морфологические особенности. 55Иэоляты, полученные на непрерывной культуре Ецаагав гапцпеагцв Швабе 1 М 1 154 - 209 до1 М 1 154213 отбирают с пластинок солодового ага.ра, инокулированных бульоном из ферментера, вкотором выращивают Ецаагцв агавпеагцпз Швабе, 60Раствор ,Глюкоза 3,0Сульфат аммония 0,25Монокалийфосфатилн КН,РО.Против онспениватель-полипропиленгликоль 2000,стерилизованный при рН 3,0 в течение ЗО мин при 10,3411104 н/м 0,01Раствор 2.Мп 80 4 Н 20 0,0005Ее 804 7 НО 0,0005Еп 804 7 НО 0,0005СоС 4 ф 6 Н 20 0,0001Сц 804 5 Н 2 О 0,0001Ма, Мо 0, 2 Н, О 0,0001.Стерилизуют в течение 15 мин при 10,3411 н/мРаствор 3.Биотин 0,10 или 20 мкг/лХолин 0,1 или 2 мг/лМети онин 0 или 600 мг/л.Стерилизуют раздельно путем фильтрации. Всерастворы вносят асептически в резервуар, помещенньй в хемостат емкостью 8,5 л при следующих условиях роси.Температура 30 С, аэрация 1 объем/м, перемешивание при 800 об/мин на турбинно-дисковой ме.шалке с 6 лопастями в ферментере с отбойником.В ферментере поддерживают рН 5,0 путем автоматического добавления стерильного аммиака. Сос.тав раствора 3 меняют через различные интервалывремени для определения максимума различнымидобавками, например, биотина или биотина с холином.1.корость роста 0,1 - 0,15 час.Пять изолятов имеют следующие морфологи.ческие свойства,Среда, Картофельный агар с сахарозойАгар Чапек-Докс (оксоид),Промывают 250 г картофеля, измельчают, по.мешают в .пресс-варильник под давлением10,3411 104 н/м на 15 мин.Отвар пропускают через двойной слой муслина. 0,3 4154245 на глюкозе (солевой среде при 30 С прн непрерывных культуральных условиях с лимитированием углерода при скорости разбавления.0,1 - 0,15 час ,.Из ферментера отбирают пробы с интервалами, примерно, в 100 час для определения вариантов. Изоляты 1 М 1 154209 - 154213 отбирают с пластин, приготовленных с 1100 час образца, Эти изоляты представляют главные виды морфологического варианта, полученного в процессе ферментации, В приведенных в примере условиях варианты появляются на пластинах послеъцц час. С этого времени они вепрерьтвно образуются, и йопуляции медленно меняется в процентах каждого вида.При этом используют в ферментере культуральную среду состава,%:5В мутный фильтрат добавляют 2% глюкозывместе с 2% агара, после чего среду автоклавируюти диспергируют.Условия роста: 25 С.Характер роста, Гцвагцв Цгавпеагцв 8 сЬваЬеЯ 1 М 1 154209,Колония морфологически аналогична исходнойАЗ/5 за исключением того, что диаметр колониименьше и равен 1,5 см через 3 дня при 30 на ЧДА,Хлопьевидный воздушный мицелий различен в ко.лониях, но меньше чем у У 1 М 154211, Старыекультуры обнаруживают побурение мицелия,С обратной стороны желто. бурые до серо-розо-.вых секторов с некоторой пигментацией, Ровап ову ав 1 пеагцв 8 сЬааЬе йф 1 М 1 154211,Интенсивный белый с хлойьевидным опущением воздушный мицелий, Диаметр колоний меньше, чем у исходной АЗ/5,2 см через 3 дня при 30 наЧДА, С обратной стороны сегменты от оранжеворозового до серовато. розового.Ецаагвв Цгаюпеагов 8 сЬмаЬе Х 1 М 1 154212.Микроскопически похож наЕцаапов ягап,"пеагцв 1 М 1 154211, но с обратной стороны. светлее(от оранжево-розового до прозрачного),Еовагав Ягавпеагцв 8 сЬваЬе У 1 М 1 154213.Небольшие колонии куполообразной формы,Мицелий короткий, спутанный, со склонностью кобразованию спиралей, Многие спородохийобразыеструктуры имеют розоватый вид у начала полосы.Розовая окраска на периферии. Диаметр колонии6,4 см через 3 дня при 30 на ЧДА.Ецзагцв Дгавпеагов 8 сЬааЬе Мф 1 М 1 154210.Вид очень нестоек и непрерывно меняется довида 1 М 1 154213. Похож на 1 М 1 154209, колонииимеют несколько больший диаметр (2,4 см через 3дня и более). Вид 1 М 1 154210 более стоекчем 1 М 1154213.Конндии.Еозагов цгавпеагов 8 сЬваЬе У 1 М 1 154209,Образуются обильныемикроконидии аналогично исходному АЗ/5.В старых культурах образуются спородохии.Индивидуальные макроконидии похожи на исходный АЗ/5 по форме и размерам, 25-50.3,0-5,0 мкм,В старых культурах образуется много спородохий,В мицелии этого вида обильны хламидоспоры,интеркамерно и терминально. Они шарообразны10-12 мкм, Иногда отдельная клетка микроконидии образует хламидоспору.Еоааг ов агав веагов 8 сЬваЬе 1 М 1 154211.Меньше микроконидий, чем у 1 М 1 154209,меньше размером, проще, 1 перегородки, длиной25.35 мкм. Образуется немного спородохий.Обильные хламидоспоры, инеркалярно, отдельные и в цепочках.Ецзаг вв угав гоеагцв 8 сЬааЬе 1 М 1 154212.Похож на 1 М 1 154211, но имеет больше макроконидий, по количеству столько же, сколько у вида1 М 1.154209.Ецзагщв цгавпеагов 8 сЬмаЬе 1 М 1 154213,Макроконидий мало, имеются типа спородохнивплоть до пачек хламидоспор. Много хламидоспорв мицелии. Макроконидии меньшего размера, чем уисходного, 30-35 4 мкм с 2 перегородками.Ецзагогп цгарфбпеагцв 8 сЬааЬе 1 М 1 154210,Похож на вид 1 М 1 154209, с обильными макроконидиями и хламидоспорами. Типичные макроконидии, 35-454 мкм,Температуру инкубации поддерживают в предел лах 25-34 С (предпочтительно 30 С), инокуляциюпутем предварительной стадии проращивания 2-10%инокулята, обычно от 5-10%.рЯ субстратной среды в процессе инкубацииподдерживают в интервале 3,5-6,7, способствующем15, максимальному росту.Период роста при серийном культивировании вуказанных условиях составляет обычно 20. 48 час.Как при периодическом, так и при непрерыв..ном культивировании следует проводить аэрирование и перемешивание, обеспечивающее достаточноесодержание растворенного кислорода и преодоле.ние его дефицита, лимитирующего рост,В субстратной среде должно быть достаточноеколичество основных питательных источников аэо.Ф .та, серы, фосфора.Для обеспечения максимальной скорости ростанеобходимо наличие витаминов, например биотина.В субстратную среду добавляют нетоксичныйпротивовспенйватель для регулирования пенообраЭО. зования в процессе ферментации.Образующийся мицелий отделяют путем промывки, фильтрации и сушки. При снижении содержания влаги до 50% путем фильтрации под давле.нием последующую сушку не проводят в строгом65 температурном режиме. Способ сушки не долженснижать питательную ценность мицелия, поэтомусушку ведут воздушной струей при 75 С иливымораживанием (сублимацией) .Получаемый по предлагаемому способу грибко 40 вый мицелий связывает воду и может использо.ваться в качестве сгустителя или желирующегосредства.Не будучи изолятом он сохраняет витамины ипрочие питательные вещества, например липиды и4 Ь некоторые углеводы.Грибковый мицелий имеет, удовлетворительныесвойства выпекания и может быть использован впроизводстве обогащенного белком хлеба и заку.сок.бО Благодаря волокнистой структуре грибковыймицелий можно печь, жарить, готовить иэ негосдобу и друтие пищевые продукты по виду иприемлемости сравнимые с обычными пищевымипродуктами.М, Приме р 1, Готовят 10 л культуральной сре.ды и стерилизуют в ферментере при перемешиваниисоставаМелассу (сахарный тростник) доь% вес. ооъем сахара60 Сульфат аммония1,2%540578 Высушенныйтав,%:Общий азотЗолаЛи лидыйРОор концентрация, %4,0 Конечная 0,8 0,2 0,2 0,025 0,0005 0,0005 0,0001 Таблица 1,Компонентыкультуральной среды Конечный % рн ГлюкозаСульфат аммонияКНг РОаРе 8047 НгОМп 804 4 НгОСц 80.5 Нг ОМд 804 7 Нг ОЙа, МоО 2 Н,ОСоСггф 6 НгОСаСгг 2 Н, ОМаОН 3,0 3,00,71,00,0010,00050,00010,00010,00010.1 500,00150,1 5,0 3,5 йа, Нг РО 0,25%Стерилизуют 30 мин при 10,3411104 н/м,СаСОЭ 0,5 вес,%/объемСтерилизуют 3 часаКомпоненты среды вносят асептически и охлажденными до 30 С.Инокулум, эквивалентный 5-10 об.% культуральной среды, выращенный на среде глюкозы(замочной жидкости кукурузы) или на другомсоотвествующем материале в колбе-качалке, инокулируют суспензией спор организма, содержанийштамм Еоаапив фгапипеагопг 8 сЬваЬе 1 М 1 145425,Выращивают 18.24 час при 30 С во вращающеисякачалке и вносят асептически в ферментер.ферментер, инкубированный при 30 С; пере- рмешивание при 800 об/мин с помощью турбинег:дисковой мешалки с 6 лопастями и отбойником,при аэрации через среду стерильного воздуха1 об/мин.Через 35 час извлекают выросший мицелий, 20центрифугируют, промывают водой и сушат наоленточной сушилке горячим воздухом при 75 С. продукт имеет следующий сос 8Ж 5,32,752 в пересчете на общий азот 30Пример 2, Готовят 10 л культуральной среды и стерилизуют в ферментере емкостью 14 л (НЫО- Бунсвик, Микроферм) .Данные о составе культуральной среды приведены в табл 1,Указанную культуральную среду стерилиэуют при нагревании 15 мин при 10,3411 ф 104 н/мг, после чего в нее добавляют стерилизованные вита М мины или аминокислоты.Растворы вносят в ферментер асептически. Инокулум выращивают и вносят аналогично примеру 1, но конечную концентрацию в ферментере доводят до 0,5 г воэдушносухого мицелия на 1 л. 60 Условия выращивания: температура 30 С аэра. ция 1 об/мин, скорость мешалки регулируют для поддержания в.культуральной среде растворенного кислорода на 25% выше концентрации насыщения измеряемой прибором фирмы Нью-Брунсвик Инк,Стерильный противовспениватель - пропиленгликоль 2000 добавляют для подавления пенообразования, а рН поддерживают в интервале 6,0-6,3 добавлением стерильного раствора едкого калия,При выращивании культуры микроорганизмов без добавления стерилизованных витаминов или аминокислот скорость их роста очень медленная, а при добавлении последних с конечной концентра. цией биотина 50 мкм/ л в 1 ультуральной среде скорость роста равна 0,2 час . При добавлении в культуральную среду стерилизованных витаминов или аминокислот с конечной концентрацией биоти. на 50 мкг/ л, хлорида холина 30 мг/ л и метионина-4.300 мг/ л скорость роста равна 0,25 час,П р и м е р 3. Приготовляют 100 л культуральной среды и стерилизуют в ферментере емкостью 130 л из нержавеющей стали. КомпонентыГлюкозаКукурузная замочная жидкость(50% твердого вещества)Сульфат аммонияКН Р 04М 804 7 Нг Огп 8 О 7 Н ОРе 804 7 Нг ОМп 804 4 Нг О Среду стерилизуют 30 мин при рН 3,0 и 10,3411н/м, затем охлаждают до 30, рН регулируют до5,0 стерильной добавкой аммиака, Биотин стерилизуют фильтрацией, вносят асепти чески, обеспечивая конечную концентрацию 40 мкг/л. Ферментер инокулируют 10 л культуры, выращен. ной в резервуаре в течение 18 час при 30 о на среде, содержащей, %: 2 глюкозы,0,4 триптона (оксоид), 0,1 дрожжевого экстракта (оксоид) 0,15 сульфата аммония, 1 монокалийфосфата, 0,1 едкого патра, 0,025 сернокислого магния, 0,001 сульфата двухвалентного железа, 0,001 сернокислого цинка, 0,0005 сульфата марганца, 0,001 сульфата меди, 0,05 противо.вспенивателя-пропиленгликоля 2000, стерилизованной 45 мин при 10, 34110 10 н/м, инокулированнойсуспензией спор штамма. Гоаапвв дгагппеагцгпШвабе 1 М 1 145425,оУсловия выращивания: температура 30, аэрацию регулируют в соответствиис необходимой концентрацией растворенного кислорода на 10% выше концентрации насьпцения в культуральной жидкости.Для подавления пенообразования добавляют полипропиленгликоль 2000, поддерживая рН около 5,0 путем добавления стерильного аммиака. Образ..5 льтурал им Сульфат в Полипрол ото среду 0,025 0,025и рН 40.гнияленгликоль 2000 (объем/в т ЗО н при 10,3411 104 н составл.ерилизч Крахмал бобовыхамилазой)Кукурузная замочнСульфат аммонияМонокалийфосфат вносят в 8,5 л хемостат в при рН 3,5 - 6,0 и скорости е об условиях выращивани ведены в таблЗ,Т б 3 Сред примеру Данн низма прсловиях по ста 0,1 час . микроорга. 4,0 5,0 60 б,б 7,1 5,9 Раствор 1. Г коза (стерилизация Н 3,0 в течение6. Культуре 5.вают н26-34 С Пр имерже, что в примерН выдержипроцесса при30-32 С.Примеремкостью 1 л з льная среда и услов отдельно при р 10 мин при 6,8 Раствор 2, Сул Мондк алийфосф97 Н 2 О ВО(Н ), МпВО 4 4 Н 2 О овне 5,0 в течение всего птимальная температура 3,0 0,565катные кол00 мл средыация,%: 0,0250,00050,0005 ы.качалки едующего60 О 61 Н полня ю состава, конеч концепт цы мицелия после выращивания содержат в пере. счете на сухой вес: общий азот - 8,0 - 8,6%; азот альфааминокислот - 6,4- 6,6%, Нана чьная скорость роста в комплексной среде, полученной из культу.-1 ральной среды и инокулума, равна примерно 0,3 час,Ниже приводятся примеры 5 и 6, выполнения предлагаемого способа при непрерывном культивированииПри мер 4, Готовят культуральную среду следующего состава; 16 тйсхъюОЬ 2 1 конечная концентрация,%;тГлюкоза 3,0Сульфат аммония 0,25Монокалийфосфатили КН 2 РО 0,3 Ьь Сульфат магния 0,025Полипропиленгликоль 2000 0,01т".терилизуют при рН 3,0 ЗО мин при 10, 3411 н/м . Раствор 220 бработан альфа 0,3 углеводов я жидкость 1,330,25 0,15 Стерилпзуют 15 мин.Раствор 3,Витамины и/или аминокислоты стерилизуютфильтрацией, как зго описано ниже. Все растворы вносят асептически.Условия выращивания в хемостате емкостью 8,5 л следующие,Температура 30 С, аэрация 1 об/мин, перемешивание при 800 об/ мин с помощью шести- лопастной турбинно-дисковой мешалки в ферментере с отбойником.В качестве микроорганизма используют штамм Гыагагп цгагп 1 пеаг 12 гп 5 с 12 ааЬе 1 М 145425, рН 5,0 поддерживается автоматически добавкой стериль. ного аммиака.Данные об условиях выращивания микроорганизма приведены в табл, 2.Редактор Корректор И, Золотовская 6062/7 Тираж 555 Подписное ЦИИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул Проектная, 4 0,0001 0 0001 0,00150,0000010,2проводят при 10,3411 е 10" н/м при конечном рИ 6,0,Раствор 3, Витамины стерилизуют фильтрацией. Растворы вносят асептически, обеспечивая конечный объем 200 мл, затем колбы инокулируют промьпыми спорами штамма Ецаагцгп угапзгпеагцпз 8 сЬиа Ье 1 М 1 154209 до концентрации 8 10/мл.Условия роста; температура 30, 140 об/мин на орбитальной качалке с дугой качания 508 мм,Через час интервалы измеряют рост путем определения оптической плотности образца при ,600 ммк,При выращивании микроорганизма штамма Ецваггцагаппеагцгп сасЬ 222 аЬе 1 М 1 154209 на среде, не включающей раствора 3, скорость его роста очень медленная.При включении раствора 3 в среду и конечной . концентрации биотина в ней 50 мкг/л скорость роста составляет 0,22 час .При включении раствора 3 в среду и конечнойконцентрации биотина в ней 50 мкг/л и хлористого холина 50 мг/л скорость роста составляет 0,27 час.При вьзращиваияи 252222 сроорганизмов штаммовЕцваг впз дгаегпеагцп 2 ЯсЬоаЬе 1 М 1 154211 1 М 1 154212, 1 М 1 154213, 1 М 1 154210 и 1 М 1 145425 на среде, описанной в примере 7, без включения раствора 3 стерилизованных фильтрацией витаминов скорость их роста очень медленная.1 ри выращивании указанных штаммов на той же среде с включением в нее раствора 3 стерилизо 12ванных витаминов при конечной концентрации био.тина в купыре 50 мгк/л, скорость роста равна021-022 час, а с добавлением Оиоччбна 150 мгн/л)и хлористого холина (50 мг/л) - 0,27 час . Фо рмула изо б р е те ни я 1. Способ получения протеинсодержащего вещества путем выращивания грибов родаРцвапцпз ваэробных условиях в водной питательной среде, 19 содержащей источник углерода в виде утлевода,источник азота, минеральные соли и стимуляторыроста, с последующим выделением полученногопродукта из культуральной жидкости, о т л и ч аю щ и Й с я тем, что, с целью повышения качества 15 полученного продукта, из грибов родаРцаапцпзиспользуют вид Ягапппеагцв.2, Способ по п.1, отличающийся тем, чтоиз вида гагп 2 пеагцгп используют штамм ЯсЬваЬе.за У 1 М 1 14542 з.293, .Способ по п,п.1,2, о т л и ч а ю щ и й с я тем,,что, из вида Ягапзпеагцпз используют штаммы заИб 141 154209 1 М 1 154211, 1 М 1 154212 1 М 1 1542131 М 1 154210.4. Способ по п и, 1 - 3, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что выращивание проводят при рН преимущественноравном 3,5-7.5. Способ но п п. 1 - 4, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, в качестве стимулятора роста используют биотин.б, Способно пп. 1 - 4, от лича ющи й ся тем,что, в качестве стимулятора роста используют холин.7. Способ по пи, 1 - б,отличающий ся тем,что способ осуществляют при козффициенте разбавления среды предпочтительно равном 0,1 час,