Способ получения пигмент-белкового комплекса из растений

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз СоеетскивСоциалистическихРеслублии К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(23) Приоритет -Государственный комитет ССС Р по делам изобретений и открытийОпубликовано 300782Бюллетень М 9 28 1531 УДК 581.174, . 2 (088. 8) Дата опубликования описания 30.07.82 г-,Л. В. Пивоварова, А. С. Казакова, Л. ф. Н кзяаева и А. А. Кононенко Московский ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. М.В.ЛомоносоваИзобретение относится к способамвыделения биологических Функций иможет быть применено в биохимии,сельском хозяйстве, фитопатологии,растениеводстве.Известен способ выделения пигмент-белкового комплекса (ПБК) иэрастений путем гомогенизации растительной массы с трис-НС 1-буфероми детергентом с последующей очисткойдифференциальным центрифугированиеми гель-электрофореэом (11.Способ имеет следующие недостаткидлительность; нестабильность целевого продуктат необходимость использования большого количества растительной массы,Известен также способ полученияПБК путем гомогенизирования растительной массы в смеси с трициновымбуферсяи при рН 8,5, последующей обработки сульфатом аммония, дифференциальным центрифугированием при16000 я в течение 60 мин, ресусендирования осадка, центрифугированияпри 20000 я в течение 90 мин и последующей очисткой ПБК гельфильтрацией(21,Недостатки способа - длительность,,(выделение ПБК занимает 18-19 час);громоздкость; кроме того, в иэвестном способе высокое разбавление це= левого продукта,Цель изобретения - ускорение и упращение способа получения ПБК из растений, обладающего, высокой Фотоактивностью. Эта цель достигается тем, что растительную массу гомогениэируют в среде следующего состава, вес.ВСахароза 6,84-13,68Магний хлористый 0,009-0,028Натриевая сольэтилендиаминтетра 15 уксусной кислоты 0,027-0,067Тритон Х0,05-0,1Глицерин 10-30Трис-НС 1-буфер ОстальноеКроме того, растительную массу 20 берут в соотношении к среде выделения1:1, а последующее центрифугированиепроводят при 49000-51000 я в течение25-35 мин. 25 Предлагаемый способ занимает6-7 ч, не требует большого количества растительной массы (не более18-20 г), не громоздок, целевой продукт обладает стабильностью и высо кой фотоактивностью.45 П р и м е р 1. Берут 18 г охлажденной растительной массы, растираютв среде выделения состава, вес.Сахароза 6,84Магний хлористый 0,009Натриевая соль 5этилендиаминтетрауксусной кислоты 0,027Тритон Х0,05Глицерин 10Трис-НС 1-буфер Остальное 10Гомогеиат фильтруют через шестьслоев капрона и центрифугируют при49000 д 25 мин. Осадок отбрасывают,а супернатант используют для получения очищенного ПБК. Для этого сУпернатант наносят на колонку, заполненную сефадексом 6-100 размер колонки35 х 3,0 см скорость тока 0,5 мл/мин,объем фракций 5 мл).Наличие пигмента во фракциях определяют, записывая спектры низкотемпературной флуоресценции темновых иосвещенных образцов. Затем фракции,содержащие ПБК, объединяют и длядальнейшей очистки пропускают. через.колонку с сефадексом С(размерколонки 20 х 3,2 см, скорость тока0,5 мл/мин, объем фракций 5 мл).В качестве элюирующего раствораиспользуют трис-НС 1-буфер, 0,6, рН8,4, содержащий 1,4 КС 1, В процессе очистки препаратов температуруоколонок поддерживают при 0 с помощью охлаждающей рубашки.Все операции проводят на слабомзеленом свету при 0-4 С.о35Добавляют глицерин до 45 (повесу от среды выделения), получаютстабильный фотоактивный ПБК, которыйхранят при -18 С несколько недель,фотоактивность при этом не теряется. 40П р и м е р 2. Берут 20 г охлажденной растительной массы, растираютв среде выделения состава, вес.:Сахароза13,68Магний хлористый 0,028Натриевая соль этилендиаминтетрауксуснойкислоты 0,067Тритон Х0,1Глицерин50Трис-НС 1-буфер ОстальноеГомогенат фильтруют через шестьслоев капрона и центрифугируют при51000 д 35 мин. Осадок отбрасывают,а супернатант используют для получения очищенного ПБК. Для этого супернатант наносят на колонку, заполненную сефадексом 6-100 (размер колонки35 х 3,0 см, скорость тока 0,5 мл/мин,объем фракций 5 мл).Наличие пигмента во фракциях определяют, записывая спектры низкотемпературной флуоресценции темновых иосвещенных образцов,Затем фракции, содержание ПБК,объединяют и для дальнейшей очисткч 65 пропускают через колонку с сефадексом 6-200 размер колонки 20 х 3,2 см,скорость тока 0,5 мл/мин объем фракций 5 мл), В качестве элюирующегораствора используют 0,6-ный трис-НС 1-буфер, рН 9,0, содержащий1,4 КС 1..В процессе очистки препаратовтемпературу колонок поддерживают при0 с помощью охлаждающей рубашки.Все операции, связанные с получениемПБК, проводят на слабом зеленом свету при 0-4 С.Добавляют глицерин до 55 вес.от среды выделения. Получают стабильный фотоактивный ПБК, который хранятпри -18 С несколько недель, Фотоактивность при этом не теряется.П р и м е р 3. Берут 20 г охлажденной растительной массы, растираютв среде выделения состава, вес.:Сахароза 10,26Магний хлористый 0,019Натриевая соль этилендиаминтетрауксуснойкислоты 0,033Тритон Х0,06Глицерин 20Трис-НС 1-буфер ОстальноеГомогенат фильтруют через шестьслоев капрона и центрифугируют при50000 д 30 мин,Осадок отбрасывают, а супернатантиспользуют для получения очищенногоПБК. Для этого супернатант наносятна колонку, заполненную сефадексомС(размер колонки 35 х 3,0 см,скорость тока 0,5 мл/мин, объем фракции 5 мл) .Наличие пигмента во фракциях определяют, записывая спектры низкотемпературной флуоресценции темновыхи освещенных образцов. Затем фракции,содержащие ПБК, объединяют и для.дальнейшей очистки пропускают черезколонку с сефадексом-200 (размерколонки 20 х 3,2 см, скорость тока0,5 мл/мин, объем фракций 5 мл), В качестве элюирующего раствора используют 0,6-ный трис-НС 1-буфер, рН 8,6,.содержащий 1,4 КС 1. В процессе очистки препаратов температуру колонокОподдерживают при 0 С с помощью охлаждающей рубашки.Сбор материала и все операции, связанные с получением ПБК, проводят наслабом зеленом свету при температуре0-4 С,Добавляют глицерин до 50 вес,от среды выделения.Получают стабильный фотоактивныйПБК, который хранят при -18 С, несколько недель, Фотоактивность приэтом не теряется. Формула изобретения1, Способ получения пигмент-белконого комплекса из растений, включа946453 Составитель М. МирзаевРедактор И. Ковальчук Техред А, Бабинец Корректор М, Юароши1 Заказ 5379/2 Тирам 699 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-. 35, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП "Патент", г. Укгород, ул, Проектная, 4 ющнй гомогенизирование растительной массы с добавлением буфера, Фильтрование, центрифугирование и очистку при низкой температуое пропусканием через колонки с сефадексом, концентрирование с последующим добавлением 5 глицерина, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, гомогенизирование проводят в среде выделения состава, вес.ЪСахароза 6,84-13,63 1 ОИагний хлористый 0,009-0,028Натриевая сольэтилендиаминтетрауксусной кисло 0,027-0,067Тритор х0,05-0,1Глицерин 10-30Трис-НС 1-буфер Остальное 2. Способ по п. 1, о т л и ч аю щ и й с я тем, что растительную массу берут в соотношении к среде выделения 1 г 1 - 11,3, а последующее центрифугирование проводят при 49000-51000 д в течение 25-35 мин Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1.0 га. П. Сапааг 1 а. Апа 1 уз 1 з оЕйЬе БцЬцп 1 й Яггцс 1 цге оЕ РгойосЬ 1 о-горЬу 11 Ие Но 1 осЬгойе Ьу Яодиц Родесу 1 Бц 1 рЬайе-Ро 1 уасг 11 ащ 1 ое Б 1 есйгорЬогез 1 з. Р 1 ап 1-РЬуз 1 о 1 оду) б 0,422-429, 1977,2. НеппЫдкеп К. М., КаЬп А.РЬойоасй 1 че ЯцЬцп)1 з оГ Ргойосй 1 огорп 1111 ое Но 1 осЬгове. Р 1 ац 1-РЬуз 1 о 1 оду 47, 685-690, 1971.