Способ обнаружения неклассического вируса

(57) Изобретение относится к вирусологи ь и может быть использовано дляобцаружеция неклассических вирусовн ацалььзььруемых образцах. елью изобретения является повышение точности .Пля того отбирают пробу нцруссодержащегс материала, освобождают ее откчассическььх вирусов, вносят втуру тк.ьи астроцитон морской си которую вносят коцкананалиц А вкоццецтрацььи 2 Омкг и Н-ть н,оцсцивают уровеь; включения ими(ица н кчеточную ЛНК и при от виипропп:(ьь рации судят о налььчьси вируса. а1 табл,Й 9 .1аучно-исследова емиологии и мик л З.Б,Кцачена,Г, Рльтцк(1, Клицико-;лр зон; тика и лабораКоломиец Н, 1, логическая хараь: торная диагности Минск, 1986. а лей споцгиоза,Про;(царцтельььь)е этапы. Прежд цсс,едонать инфекционный матсри зарац с готовят ростовые среды, туру астроцитон и определяют оп ную концентрацию митогена (КонПриготовление культур астроци Источником получения культур сл новорожденные морские снинки, П эфирным наркозом вскрывают чере коробку, извлекают большие полу головного мозга и немедленно по Изогии и м зирусопцо длявирусов етение относится л жет быть ььсцользон кулья неклассическихуемых образцах.зобретеция являе на ьм пную ар ещаю.ц) аконы кса, сод ) ед/мл) чяют пин е крч о узкилушар шиети асти коры вырезают кус сочно СУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ О ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЦТИЯМПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКСНМУ СВИ(71) Белорусский нский институт эпидбиологии(56) Баринский И,Этнология хроничеинфекций. - М.: Мс, 166. н анализирелью и тся цоцншение точности.Для этого нируссодержащий материал освобождают от классических нозбудителей инфекционных заболеваний обработкой при 1 С в течение 15 миц, вводят н культуру астропитов морских свинок и сразу же н нее вносят Коц-А (в дозе 20-25 мкг/мл), через - дця дополнительно вводят Н - тцмидцн, на 3 сут о наличии возбудителя судят по потере астроцита.ли способности отвечать пролиьььерациец ььа;автоген,Сущность способа заключается в сле дующей последонат льцости опера 1 цьй. о стандартцльм раствором ржащим пенициллини гентамицин (.5 мкгмл).етом мягкую мозговую обоцые сгустки крови. Ножцими браншами разрезают болья на две части, цз облас 1654333чек ткани объемом 1-5 мм и переносят его в чашку Петри с ростовой сре"дой (сыворотка плодов коров 307,5%-ный гемогидролизат 707 с добавлением 0,2 М раствора 1,-глутамина иэ5расчета 1 мл на 100 мл среды и гентамицина 5 мкг/мл), где измельчают докусочков объемом 0,5-1 мм. Послеэтого, совместно с ростовой средойсобирают кусочки пастеровской пипеткой и пропускают через нейлоновоесито первоначально с размером пор150 мкм, а затем 75 мкм.Получают первичный моноалой, состоящий на 85-.90% из астроцитов, Дляэтого приготовленную клеточную взвесь(10 мл) переносят в культуральныефлаконы с площадью дна 22 см, помещают в термостат и инкубируют при37 С с 57. содержанием СО в течение1 недели.После образования сплошного монослоя культуральную среду удаляют, вносят 2,5 мл смеси (+37 С), состоящейиз 0, 17 трипсина и 0,027. версена всоотношении 1:5, выкидают 1-2 мин(контроль под микроскопом, до набухания клеток). Сливают смесь и пастеровской пипеткой вносят ростовую среду в объеме 5 мл, пипетируя струей,пля снятия клеточного пласта (5-10 манипуляций). Используя камеру Горяева,подсчитывают количество клеток в 1 мл,при необходимости доводят их концентрацию ростовой средой до "1 Оф кл./мл.Клеточную взвесь можно сразу переносить для культивирования в лункипластиковой панели и использовать дляобнаружения вируса или хранить в жидком азоте, восстанавливая по мере необходимости .Хранение культур астроцитов.Клетки переносят пипеткой в пробирки, центрифугируют 10 мин при45150 об/мин, надосадок удаляют, аоставшиеся клетки разводят криозащитной средой (57 гемогидролиэат, рН7,2-,4 70 Е, сыворотка плодов коров,203, глицерин 103) до концентрации2 10 кл./мл.Приготовленную суспенэию астроцитов разливают по 3 мл в стерильныеампулы и герметично закрывают. Ампулы с астроцитами поэтапно охлаждаютвыдерживанием при +40 2 ч, затемпомещают в ванночку с 967.-ным этилоовым спиртом, охлажденным до -10 С,Используя жидкий азот, замораживают клетки, соблюдая следующий режим, град/мин; ст -10 до -20 О 1 от -20,о1 до -4) 1,5; от -40 до -7 3. После чего погружают в сосуд с жидким азотом и хранят при -196 С.Жизнеспособность клеток сохраняется более двух лет.Восстановление культур астроцитов после хранения в жидком азоте и подготовка их для вирусологических исследований.Ампулы с суспенэией астроцитов извлекают из азота и немедленно помещают в водяную баню на 1-2 мин при +31 С. Затем вскрывают, содержимое. опереносят в культуральные флаконы объемом 5 мл и помещают в С 0 инкуО ег батор при +3 С. Через 24 ч меняют ростовую среду на КРП) с 107 сывороткой плодов коров и культивируют в течение 5-6 дней до образования сплошного манослоя, Монослой снимают раствором трипсина и версена, как описано выше. В камере Горяева подсчитывают количество клеток в полученной суспензии, затем разводят росте.:ой средой КРИ 1-1640 до концентрации 710 кл .,мл. Приготовленную культуру астроцитов в суспензии, внося в ячейки 96-луночных пластиковых панелей, используют для обнаружения возбудителя.Приготовление сред для культивирования астроцитов. Для приготовления первичной монослойной культуры астроцитов используют ростовую среду наоснове 57 гемогидролизата.Для постановки опыта в пластиковых панелях применяет среду КРМ 1-164).В среду добавляют следующие необходимые ингредиенты. 1-глутамин 2 мМ, антибиотики 100 мкг/мл хлоркальциевого комплекса стрептомицина и 10 ед./мл пенициллина, 107. сыворотки плодов коров, инактивированной при56 С в течение 30 мин. Для стабилизации рН среды (7,4) добавляют растворНЕРЕБ (И-гидроксиэтилпипераэин-Нэтансульфановая кислота) в окончательной концентрации 1 мИ. 11 риготовление раствора митогена. В качестве митогена используют Конканавалин А (Сопсапача 1 Ы А, Бегча) . Готовят матричный концентрированныйраствор на среде КР)11-1640, содержащий Кон-А, в дозе 100 мкг/мл, который разбавляют перед использованием до нужной концентрации. Исходя иэ того33 6 40 5 16543 что и лунки пластиковой панели приготовленную суспенэию астроцитов и раствор митогена добавляют н равных количествах (т,е. происходит раэбан 5 ление митогена в дна раза), раствори митогенон готовят в концентрациях, в дна раза превышающих необходимую (2), 30, 4 мкг/мл и т.д.).Определение оптимальной концент рации мнтогена Кон-А для стимуляции пролифератинной активности астроцитов.Определение доэоэанисимого стимулирующего эффекта митогена осуществляют внесением Кон-А в конечных концентрациях 1 О,)0,25,40 и 5 О мкг/мл в незараженные культуры астроцитов морских свинок, находящихся в лунках пластиковых панелей ( ИЗ) кл./мл ростовой среды). Для этого в каждую из 20 15 лунок с астроцитами н первом варианте опыта вносят Кон-А в О, 1 мл ростовой среды ЕРИ 1-164) (концентрация 11) мкг/мл).Во втором варианте опыта в 15 лу нок с культурой астроцитов вносят Кон в в О, 1 мл ростовой среды КР 11 - 1641) (концентрация 20 мкг/мл).В третьем варианте опыта н каждую из 15 лунок с астроцитами вносят Кон-А 30 в О, мл ростовой среды ВР 11-164) (концентрация 25 мкг/мл и т.д.).Контролем служат 15 лунок с культивируемыми астроцитами без митогена.Пластиковые панели помещают в термостат и культивируют при +3 С с 57 содержанием СО.На вторые сутки культивирования н каждую лунку опыта и контроля вносят 5 мкКм Н-тимидина в ),1)5 мл средыэКР 11-164).На третьи сутки из лунок пипеткой удаляют культуральную среду и добанляют ),2 мл физраствора, клетки суспензируют и переносят на цел;алоэные 45 фильтры с диаметром пор ),85 мкм. Затем их последовательно обрабатывают 57.-ным раствором трихлоруксусной кислоты, 96 Х-ным этиловым спиртом и переносят во флаконы с 6 мл толуолового 50 сцинтиллятора. Пролифератинную активность астроцитов определяют на жидкостном сцинтилляционном спектрометре, учитывая уровень синтеза клеточной ДНК по включению н нее Н-тимидина. 553Установлено, что индекс стимуляции пролиферации (отношение количества импульсов в 1 мин н культурах астроцитов с Кон-А к количеству импульсов в 1 ьин в культурах без Кон-А) наиболее нысокий при внесении Кон-А в концентрации 2)-25 мкг/кл, алые концентрации Кон-А (1 О мкг/мл) на третьи сутки вызывают более низкую стимуляциюпролиферативной активности, а болеевысокая концентрация (50 мкг/мл) вообще не вызывает пролиферации клеток.Таким образом, наиболее оптимальной концентрацией митогена Кон-А длястимуляции пролиферативной активности астроцитов морских свинок являетсядоза 20-25 мкг/мл.Влияние различных концентрацийКон-А на пролифератинную активностьастроцитов морской свинки показанов таблице.Инфекционный материал (нервнаяткань людей, животных, культура клеток и т.п.) гомогенизируют, добавляютфизраствор, центрифугируют при60)О об/мин 15 мин и удаляют осадок.Надосадок обрабатывают в водянойбане при 1 О С в течение 15 мин.В 45 плоскодонных лунок пластиковой панели вносят взвесь астроцитонв объеме 0,1 кп ростовой среды, содержащей 2 1) клеток и инкубируют. Ьв термостатах при +3/ С с 5 Х содержанием СГ,Через 2 ч в первые 15 лунок вносятпо ),05 мл обработанного вируссодержащего материала и сразу же в нихдобавляют по О, мл Кон-А в дозе20-25 мкг/мл . Во вторые 15 лунок(контроль митогена) вносят ло ),05 млсреды культивирования и О, 1 мл Кон-Ав дозе 20-25 мкг/мл. В оставшиеся15 лунок (контроль опыта) вносяттолько по ,05 мл среды культивирования беэ митогена.Культуры помещают в термостат иинкубируют при +37 С с 57, содержанием СО 2,На вторые сутки в каждую лункуопыта и контроля вносят 5 мкКиН"гимидина в ),1)5 мл среды культивирования.Обнаружение возбудителя проводят на третьи сутки, используя жидкостный сцинтилляционный снектрометр,определяют пролифератинную активностьастроцитов по включению Н-тимдинав клеточную ДНК, учитывают количество импульсов в 1 мин н опытных иконтрольных культурах. Присутствиевозбудителя устанавливают по потереинфицированными астроцитами способ 1654333ности отвечать пролиАерацией на дей-ствие митогена.П р и м е р 1. Обнаружение возбудителя амиотройического лейкоспонгио 5эа (АЛ) в ткани ЦНС больного 1.Иэ мозга (кора больших полушарий)через 3 ч после смерти выделяют кусочек ткани (0,3 г), помещают в ступку,гомогениэируют, добавляют 2,7 мл Аизраствора, переносят суспензию в пробирку и центрийугируют при 6000 об/минв течение 15 мин. Собирают надосадоки прогревают при 100 С 15 мин в водяной бане. 15В первые 15 лунок пластиковой панели, содержащей культуру астроцитов,вносят 0,05 мл обработанного, как указано выше, надосадка суспенэии мозгабольного Д. и сразу же в эти лунки 20добавляют О, 1 мп Кон-А (в дозе25 мкг/мл).Во вторые 15 лунок пластиковой панели с культурой астроцитов вносят0,05 мп среды КРМТи добавляют 25О, 1 мл Кон-А (в дозе 25 мкг/мл).В контрольные 15 лунок пластиковойпанели с культурой астроцитов вносяттолько 0,05 мп среды КРМХ) безмитогена, 30Пластиковые панели помещают в термостат и инкубируют при +37 С с 57содержанием СО,На вторые сутки во все лунки с астРоцитами в опыте и контроле вносят 355 мкКк Н-тимидина в ),15 мп средыКРМ 1-1640.На третьи сутки пипеткой удаляюткультуральную жидкость, добавляют вкаждую лунку 0,2 мл физраствора, клет ки суспенэируют и переносят на целлюлоэные фильтры с диаметром пор0,85 мкм. Обрабатывают фильтры 57.-нымраствором треххлоруксусной кислоты,промывают 96%-ным этиловым спиртом, 45высушивают и помещают во Флаконы столуоловым сцинтиллятором. ПролиАеративную активность оценивают по включению Н-тимидина в клеточную ПНК.Уровень включения Н-тимидина в пер 50.вых (опытных) 15 лунках с внесеннымвируссодержащим материалом и митогеном - 5380+240 имп/мин, во вторых,"590 имп/мин. Разница между средним числом импульсов с учетом средней ошибки в опыте (первые 15 лунок) и контроле опыта статистически незначима, а разница между средним числом импульсов в стимулированных митогеном астроцнтах (контроль митогена - вторые 15 лунок) и контролем опьгга статистически значима, т.езараженные астроциты не отвечают пролийерацией на внесенный митоген.Таким образом в ткани ЦНС больного Д. содержится возбудитель АЛ. Посмертная верификация заболевания амиотроФической лейкоспонгиоз.П р и м е р 2. Обнаружение возбудителя АЛ в ткани ЦНС больного Л.Проведено взятие ткани объемом 0,5 см из области центральной извилины коры больших полушарий головного мозга. Обработку вируссодержащего материала, последующее заражение клеток, внесение митогена Кон-А, (концентрация 20 мкг/мл) и подсчет пролиферативной активности проводят, как описано в примере 1. В зараженных культурах стимулирующего действия Кон-А на астроциты не отмечено. Уровень включения Н-тимидина в клеточЭную ДНК, имп/минф 6150+955 (опыт);12850+354 (контроль митогена);589 М 340 (контроль опыта) .Таким образом; внесение суспензии ткани мозга больного Л. в культуру привело к потере астроцитами способности отвечать пролийерацией на митоген. В ЦНС больного Л. находится возбудитель АЛ.П р и м е р 3. Определение возбудителя АЛ в ткани ЦНС морской свинкиэкспериментально воспроизведенным заболеванием.Морской свинке инокулируют интрацеребрально О, 1 мл 107-ной суспензии мозга больного Д., умершего от АЛ. Через 1,5 мес после заражения у него появляются клинические признаки заболевания, проявляющиеся в выпадении шерсти, атрофии мышц, развитии парезов и параличей конечностей и туловища. В терминальной стадии заболевания у животного под эфирным наркозом берут мозг для вирусологических исследований. Обработку и внесение вируссодержащего материала в культуру астроцитов морской свинки проводят как описано в примере 1. Через 3 дня определяют пролиеративную активность астроцитов по уровню включения Н-ти- э15 мидина в ДНК. В зараженных культурах стимулирующего действия митогена на астроциты не отмечено. Уровень включения Н-тимидина в кпеточную ДНК,3имп/мин: 4980+350 (опыт), 1 050 ь 91 Н) (контроль митогена); 5420+570 (контроль опыта) .Таким образом, в ткани 1 НС исследованной морской свинки находится возбудитель АЛ.П р и м е р 4 . Определение персистенции возбудителя АЛ в ионослойных культурах клеток, полученных из мозга больного Д., умершего от АЛ.Сливают культуральную жидкость, механически отделяют клетки (около 1000 клеток), добавляют 5 ил физраствора и переносят в пробирку. Дают клеткам 15-20 иин отстояться, сливают Физраствор, 3-кратно замораживают и размораживают, гомогенизируют и обрабатывают, как описано в примере 1. После этого вируссодержащий материал вносят в культуру астроцитов 25 морской свинки. Через 3 дня исследуют уровень включения Н-тимидина в клеточную,НК. В зараженных культурах стимулирующего действия Кон-А в дозе 25 мкг/мл на астроциты не отмечено. 3 О Уровень включения Н-тимидина в клеточную /НК составляют, имп/мин; 4778+ +294 (опыт); 14001 ф 200 (контроль митогена); 49 ЬО+310 имп/мин (контроль опыта).35Таким образом, в монослойной культуре клеток, полученной от больного Д., персистирует возбудитель АП.П р и м е р 5. Определение влияния очищенных препаратов возбудителя АЛ 4 О на астроциты.Культуральную жидкость, полученную иэ монослойной культуры мозга больного Д (титр возбудителя АЛ в культуральной жидкости 5 1 18 ИЦ 5/мл), 45 обрабатывают как в примере 1, затем концентрируют 8 раз сухим полиэтиленгликолем и вносят по 0,1 мл в лунки пластиковой панели с культурой астроцитов, учитывают так, как описано ранее. В зараженных клетках стимуляции пролийерации Кон-А в дозе 25 мкг/ип не отмечено. Уровень включения Н-тимидина в клеточную ДНК, имп/мин: 6201 ф 35 Ь (опыт); 13240+450 (контроль митогена); 5780675 (контроль опыта) .Таким образом, внесение очищенных препаратов возбудителя АЛ в культуру привело к потере астроцитами способности отвечать пролиАерацией на митоген,П р и м е р 6. Больной П. Патологоанатомический диагноз - болезнь Иильдера.Вирусологическое исследование ткани 1 НС проводят, как описано в примере .Как в первых 15 лунках с внесенноймозговой суспенэией больного ПВ, таки во вторых 15 лунках, не содержащихкакого-либо дополнительного материалапод действием Кон-А в дозе 25 икг/ил,отмечается увеличение пролийеративнойактивности астроцитов, Уровень включенияН-тииидина в клеточную ДНК,имп/мин: 12384+405 (опыт 13233+370(контроль митогена); 5100+З 10 (контроль опыта).Таким образом в 1 НС больного ПВвозбудитель АЛ отсутствует.П р и м е р 7. Больной П. Патологоанатомический диагноз - амиотроФический боковой склероз.Вирусологическое исследование ткани проводят, как описано в примере 1,Как в первых 15 лунках с внесенноймозговой суспензией, так и во вторых15 лунках, не содержащих какого-либодополнительного материала под дейстзием Кон-А в дозе 25 мкг/ип, отмеченоувеличение пролиферативной активности астроцитов. Уровень включенияЭН-тииидина в клеточную ДНК имп/мин;12820+290 (опыт); 13115+570 (контрольмитогена); 549)+520 (контроль опыта).Таким образом в 1 НС больного П.неклассический вирус АЛ отсутствует.формула изобретенияСпособ обнаружения неклассического вируса, включающий отбор пробывируссодержащего материала, освобождение его от классических вирусов,внесение его в культуру клеток с последующей оценкой наличия вируса,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью повышения точности, в качестве культуры используют астроцпты морской свинки, в которую вносят конконавалин А в концентрации 20-25 мкг/мли Н-тимидин, а оценку проводят повключению Н-тимидина в клеточнуюДНК и при отсутствии пролиЛерлцинсудят о наличии вируса,=-Оф 79Р)0, )5 1,5с=8,45РС), И 1 2,0с 5 5Р001 1,5с=3, 29РСО, )1 Редактор Н.Гунько Заказ 193 Тиразк 394 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Рауюская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент"г,уагород, ул. Гагарина, 1 О 1 Астроциты, обработанные Кон-А, имп/минАстроциты беэ Кон-А, имп/мин Индекс стимуляции пролиферацииР Зависимость уровня включения Н-тимидина в ДНК клеток3от дозы вносимого материала (митогена) в количестве,мгк/мл 11)440 ф 880 13088+982 805 Н 105 48201500 Составитель И.ТарееваТехред Л.Олийнык Корректор М.Самборская