Способ определения микробной резистентности организма

ных исследований к соответствующемуэритроцитарному диагностикуму, Сэтой целью 1,0 мп сыворотки разводятв 5,0 мл физиологического раствораи для осаждения конгломератов этойсыворотки ее центрифугируют при3000 об/мин в течение 30 мин. Осадокудаляют, а надосадочный раствор иммунной сыворотки разводят в 100"00 мл физиологического раствора.Одномоментно ставят шкалу, позволяющую оценить активность антигена,блокированного исследуемой кровью. К0,1 мл микробного антигена различнойактивности с целью уравнивания приливают по 0,1 мл Физиологическогораствора. Контролем является проба с0,2 мл физиологического раствора,К пробам крови с остаточной активностью антигена и различных разведений этого антигена в контрольных исследованиях приливают по 0,5 мп приготовленного раствора иммунной сыворотки. Пробы встряхивают и инкубируоют при 3-7 С в течение 20-30 мин,центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин.Надосадочный раствор каждой пробыпереносят в отдельные лунки 1-горяда планшета для макроварианта пос- Зотановки РПГА. В лунки этого ряда ипоследующих рядов приливают по 0,5 млфизиологического раствора и раститровывают сыворотку каждой пробы по вертикальному ряду лунок планшета, так,что в 1-й лунке ее разведение будет2-кратное,.во 2-й - 4-кратное и т.д.до 4-5-го горизонтального ряда лунок планшета и добавляют в каждуюлунку по 0,20-0,25 мл 1 -ной взвеси 40эритроцитов антигенного диагностикума. С учетом, что при исследованииантимикробной активности крови всегда проводят контрольные исследования,определяют активность антигена и иммунной сыворотки - диапазон колебаний времени и инкубации планшетовможет быть значителен и составляетсоответственно от 2 до 24 ч, температура 5-20 фС,Учет реакции проводят по 4-крестной системе; 4+ ."- все эритроцитыагглютинированы и равномерно покрывают дно лунки: 3+ - агглютинированы почти все эритроциты, но на их Фоне имеется малозаметное кольцо иэ осевших неагглютинированных эритроцитов; 2+ - наряду с равномерным агглютинатом на днелунки имеется осадокиз неагглютинированных эритроцитовв виде маленького колечка;1+ - большинство эритроцитов неагглютинировано и осело в виде маленького колечка в центре лунки.С учетом, что картина агглютинированных и осевших эритроцитов в лунках четкая, при оценке результатовисследований между 4+ и 3+, 3+ и 2+дополнительно выделяют 3,5+ и 2,5+,Иежду 2+ и 1+, 1+ и - соответственно 1,5+ и 0,5+. Такой учет результатов не вызывает трудностей, Однакоэта модификация резко повышает точность количественной оценки результатов взаимодействия крови с антигеном.В дальнейшем кресты, отражающиеактивность иммунной сыворотки,вступившей в контакт с остаточной активностью антигена в пробах с исследуемой кровью и различными разведениями этого антигена в контрольных пробах с Физиологическим раствором различных лунок по вертикальному рядупланшета складывают и получают относительную величину ее активностив +. Из полученных сумм высчитываютостаточную активность иммунной сыворотки в + после ее взаимодействияс исходным раствором, антигена и получают величину активности антигена,блокированного исследуемой кровьюили иммунной сывороткой в контрольных пробах в + или АЕ/0,1 в РТПГА.С учетом, что в микробиологииактивность антигена оценивается восновном в АЕ в РТПГА, оценку активности крови можно проводить по формулеСхАаАгде А - активность антигена в АЕ/ /1,0 мл в РТПГА, блокированного исследуемой кровью; С- остаточный титр иммунных антител после взаимодействия с антигеном в пробе с кровью в +;А - исходная активность микробного антигена в АЕ;С - исходный титр иммунных антител в +;Способ иллюстрируется следующими примерами.1640652П р и и е р 1. Влияние дибаэола на антимикробную реэистентность организма у детей.Исследование антимикробной активности крови проводили у 13 детей,5 длительно и часто болеющих, 6-летнего возраста до и после 4-недельного курса лечения дибазолом (иммуностимулятор) в дозе 0,005 1 раз в день в поликлинических условиях по вышееописанной методике с использованием 0,1 мл раствора антигена шигелл Ньюкестл, активностью 13,5 АЕ/0,1 в РТПГА.15После инкубации 0,1 мл крови с антигеном при 37 С в течение 10 мин пробы охлаждали при 3 С в течение 20 мин, приливали к пробам по 0,5 мл иммунных антител к шигеллам Ньюкестл 20 титром 16/ в 0,5 мл в РПГА. Пробы встряхивали и снова выдерживали при 3 С в течение 20 мин, центрифугировали при 1500 об/мин 5 мин и 0,5 мл надосадочного раствора проб перено сили в планшет для макроварианта постановки РПГА и определяли активность блокированного антигена кровью детей в АЕ/0,1 РТПГА.30Средняя величина активности блокированного антигена кровью детей до лечения составляет 3,1 АЕ/0,1 в РТПГА. Однако отмечаются значительные индивидуальные вариации этого35 показателя - в диапазоне от 1,0 до 4,0 АЕ С ф 16 = 3,1+0,9 (36 = 4-0,27). После проведенной терапии дибазолом отмечается статистически достоверное повышение уровня антимикробной актив ности крови у детей (Р ( 0,05), на +323. В то же время установлена.обратная зависимость между исходными величинами антимикробной активности крови у детей и изменениями их уров ней после лечения дибаэолом (г = = -0,88 + 0,07, Р(0,01).Таким образом, результаты исследований позволяют объективно контролировать эффективность лечения и прог нозировать изменения индивидуального уровня антимикробной резистентности организма у детей: с относительно низкими исходными уровнями антимикробной активности крови (3,0 АЕ и ниже) 55 отмечается значительное повышение ее уровня и, наоборот, с высокими (3,5 АЕ,и выше) отмечается незначительное повышение, изменение не выявляется или отмечается незначительное снижение этого показателя крови,Заявляемый способ позволяет с вы-;, сокой достоверностью прогнозировать уровень изменения антимикробной резистентности организма конкретного ребенка до начала лечения, что позволяет обеспечить индивидуальгчй подход при проведении терапии иммуностимуляторами в поликлинических условиях и проводить объективный контроль за эффективностью лечения.Л р и м е р 2, Изменение антимикробной реэистентности организма у детей под влиянием лечения липамидом и поливитаминами.Обследована группа детей в возрасте 3-х лет ,17 человек) из дома ребенка М 1 г, Перми. Особенность этой группы - дети закрытого коллектива с энцефалопатиями смешенного генеза. Исследование антимикробной активности крови проводили до ипосле лечения поливитаминами и липамидом в течение 2-х недель по вышеописанной методике с использованием антигена шигелл Ньюкестл активностью 10 АЕ/ /0,1 мл в РТПГА, После взаимодействия 0,1 мл крови с антигеном диагоностикума при 36 С в течение 15 мин смесь охлаждали при 7 С в течениео30 мин, приливали 0,5 мл иммунной сыворотки шигелл Ньюкестл титром 16 в 0,5 РПГА,. пробы встряхивали и дополнительно выдерживали при 7 С в тече 0 ние 30 мин, центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин,надосадочный раствор проб переносили в планшет и определяли активность блокированного кровью антигена в АЕ/О, РТПГА.Средняя величина блокированного антигена кровью детей до лечения составляет 3,3 АЕ, индивидуальные величины этого показателя, колеблются от 2,0 и 4,5 АЕ. М+6 = 3,3 + 0,9 (3 = =0,27). После проведения лечения отмечается статистически достоверное повышение уровня антимикробной активности крови у детей (Р(0,05), на + 273. В то же время установлена об-. ратная зависимость между исходными величинами антимикробной активности крови у детей и изменениями их уровней под влиянием лечения (г .-0,55 + О,8, Р 0,05), что позволяет,как и в первом примере, проводить объективный контроль за эффективностью лече 1640652ния и прогнозировать изменения антимикробной реэистентности организмапод влиянием лечения детей липамидоми поливитаминами: с относительнонизкими уровнями антимикробной активности крови (3,5 АЕ и ниже) отмечается, как правило, значительноеповышение ее уровня и, наоборот,привысокой исходной величине антимик"робной активности крови (4,0 АЕ и выше) из 6 детей только у одного ребен-ка отмечается повышение этого показателяу двух детей изменений не выявлено, а у трех - наблюдается снижение его уровня.Приведенные результаты исследований антимикробной активности кровиу детей под влиянием лечения липамидом и поливитаминами убедительно показывают возможность проводить объективный контроль за эффективностью лечения и прогнозировать ее изменение.П р и м е р 3. Изменение антимикробной резистентности организма у 25детей под влиянием лечения в санатории "Светлана" ." г.Перми,Обследована группа детей (27 человек) в возрасте от 3 и 7 лет доначала лечения и в динамике через4 недели после лечения в детском са"натории "Светлана" г. Перми с использованием методики исследования антимикробной активности крови. К 0,1 млкрови приливали 0,5 мл антигена шигелл Ньюкестл активностью 16 АЕ/0,1 мл15в РТПГА. Пробы выдерживали 13 мин при36,5 С,охлаждали при 5 С в течение25 мин, приливали по 0,5 мл иммуннойсыворотки к шигеллам Ньюкестл титром16 АЕ/0,5 в РПГА, пробы встряхивали,снова выдерживали при низкой температуре (5 С) в течение 25 мин,Пробыцентрифугировалипри 1500 об/мин втечение 5 мин, надосадочную жидкостьв количестве 0,5 мл переносили в планшет и определяли активность блокированного антигена исследуемой кровив АЕ/0,1 мл в РТПГА.Средняя исходная величина активности блокированного антигена кровьюу детей до начала лечения составляет4,6 АЕ, индивидуальные колебанияэтой величины равняются в диапазонеот 2,0 до 9,0 АЕ М+б 4,64.1,7 (36 =+5,1). Через 4 недели после лечения отмечается статистически достоверное повышение уровня антимикробной активности крови у детей (Р 0,05) на +393. В то же время отмечаетсяобратная зависимость между исходнымиуровнями антимикробной активностикрови доноров и изменения этих величин после лечения (г = в .0,56 Ж,13,Р ( 0,05),Результаты исследований позволяютсделать вывод о возможности объективного контроля за эффективностьюлечения детей в санатории и прогнозирования индивидуальных измененийантимикробной активности крови с использованием заявляемого способа: из12 детей с относительно низкими уровнями антимикробной активности крови(4,0 АЕ и ниже) у 10 отмечается значительное повышение ее активности итолько у 2 не выявляется существенное изменение этого показателя и,наоборот, у 15 детей со средними ивысокими уровнями антимикробнойактивности крови (4,5 АЕ и выше) у4 отмечается снижение, у 3 существен.ных изменений не выявлено, у 8 детейотмечается несущественное повышениеэтого показателя.Как было отмечено выше, при исследовании антимикробной активности крови в качестве стабилизатора использовали гепарин в дозе 50 АЕ/мл крови,при снижении дозы препарата до 20 -30 АЕ/мл у ряда здоровых доноров идетей отмечалось частичное свертывание крови. Достаточным является объем0,1 мл крови, снижение его до 0,05 млснижает воспроизводимость способа.Активность антигена шигелл Зонне,Ньюкестл или Флекснера ЛНИИВС составляет 8,0 и более АЕ/0,1 мл вРТПГА,В этой дозе антиген полностью блокирует активности гуморальных и клеточных антимикробных факторов цельной крови и частично сохряняет своюактивность в отношении индикаторнойдозы иммунной сыворотки, используемой для определения активности антигена, блокированного кровью. Оптимальная температура инкубации крови и антигена составляет 36-37 С, Основанием для использования этой температуры обработки смеси является энергозависимость процесса взаимодействия крови с антигеном,косвенным доказательством которой является снижение величины блокированного антигена цельной кровью при 3-18 С.Для выявления индивидуальной разницы антимикробной активности исследуемой крови оптимальное время обработки смеси составляет 10-15 мин. Увеличение времени инкубации снижает эту разницу. Этот эффект связан иммуностимулирующими свойствами индикаторной дозы антигена в отношении активности антимикробных Факторов крови. В связи с этим при увеличении времени обработки смеси при 37 С более чем 15 мин резко снижается индивидуальная разница в антимикробной активности крови у доноров или детей.Результаты исследований полностью подтверждают литературные данные о возможности некоторых микробов и их субстанций (БЦЖ и липополисахаридов) 20 стимулировать активность клеточных Факторов иммунитета.После взаимодействия крови с антиО геном пробы охлаждают до 3-7 С. В литературе известны данные, получен ные на модели исследования фагоцитар- ной активности лейкоцитов, что при низкой температуре отмечается снижение и даже полное прекращение метаболических процессов в клетках крови, 30 следствием которого является угнетение или полное прекращение антимикробной активности этих клеток, В то же время сохраняется способность антигена вступать во взаимодействие с иммунными антителами, используемая для индикации остаточной активности этого антигена.В результате исследований установлено, что индикаторная доза иммунных 40 антител в титрах при определении остаточной активности антигена в пробах с кровью составляет 8,0 и более в 0,5 мл в РПГА. Время контакта при 3-7 С антигена с иммунными антитела ми достаточно 20-30 мин. Как показали исследования, к этому сроку наблюдается полная блокада активности антигена иммунными антителами в пробах с кровью. 50Для определения неспецифической антимикробной активности крови использованы взвеси микробов шигелл Зоине, Ньюкестл и Флекснера или взвеси антигенных эритроцитарных диагнос тикумов из этих микробов. Основанием для использования антигенов дизентерийной группы микробов являются полученные с использованием заявляемого способа результаты исследований: прямая корреляционная связь между индивидуальными уровнями антимикробной активности крови к этой группе микробных антигенов.Несмотря на значительные индивидуальные колебания антимикробной активности крови к антигенам шк -елл Зонее 1 Ньюкестл отмечается высокая прямая корреляционная связь между уровнями активности блокированного антигена этих микробов (г = +0,95+ + 0,04 Р(0,01).Аналогичная прямая корреляционная связь выявлена между уровнями антимикробной активности крови доноров к антигенам шигелл Зонне и Флекснера, шигелл Ньюкестл и Флекснера (Р(0,05).Преимущества способа определения антимикробной активности крови по ее способности блокировать активность микробного антигена заключаются прежде всего в том, что эта методика отражает интегральный результат взаимодействия крови с антигеном - позволяет оценить способность гуморальных и клеточных компонентов крови снижать активность микробного антигена. Показатель антимикробной активнос", ти цельной крови на 4/5 состоит из величины блокированного антигена гуморальным компонентом крови, около 1/5 приходится на клеточные элементы крови - эритроциты, лимфоциты,фагоциты. Величина фагоцитированного антигена в антимикробной активности крови составляет не более 57, В то же время методика оценки ФагоцитаР- ной активности лейкоцитов отражает, как правило, уровень фагоцитоза 100- 200 поли- и мононуклеарных фагоцитов. Заявляемый способ отличается высо-,кой точностью - средняя ошибка непревышает 5 Х, высокой воспроизводимостью, составляющей практически1 ООЖ в сравнении с методикой оценкифагоцитоза,которая по мнению большинства исследователей в Фазе подсчета имеет ряд недостатков: субъективна, недостаточно точна и воспроиэводима.Важным преимуществом заявляемого способа является и высокая производительность труда. Для оценки результатов исследований требуется не более 1 мин. Для подсчета в 1 мазке ко" личества объектов, Фагоцитировакных12 1640652 дуется в практическую медицину дляобъективного контроля за эффективностью лечения лекарственными препаратами, обладающими иммуностимулирую-.щими свойствами, и другими способамилечения,прогнозирования неспецифической антимикробной резистентности организма. Формула изобретения Способ определения Показатели фагоцитарной активности антимикробной активностилейкоцитов (прототип) цельной крови Способ отражаетантимикробнуюактивность антител (80 ), зритроцитов(15 ) и не более 5 приходится на долю фагоцитов 100-200 поли- и мононуклеарных фагоцитов ошибка составляет не более 5ТочностьВоспроизводимостьПроизводительность низкая практически 100 не более 1 мин низкая для подсчета количества объектов фагоцитоза в 100-200 лейкоцитах требуется около30 мин - 1 чтребуются Растворы дляфиксации окраскимазков нет Составитель П.БонарцевТехред С.Мигунова Корректор Л.Бескид.Редактор И.Шубина Заказ 1264 Тираж 417 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям пру ГКНТ СССР113035, Москва, Ж Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 100-200 лейкоцитами, необходимо около 30 мин - 1 ч.В заявляемом способе не требуются растворы для,.фиксации и покраски маз 5 ков.Сравнительная оценка различных способов определения антимикробной реэистентности организма показана в таблице. 10 Заявляемый способ может конкури" ровать по точности исследования анти- микробной резистентности с радиоиммунными методами. Однако в нем не требуется меченых радиоактивным иэо. топом микробных взвесей. Определение антимикробной активности цельной крови проводится с использованием стандартизованных, доступных, выпускае ,мых отечественной промышленностью микробных антигенов дизентерийнойгруппы микробов и прилагаемых к ним )иммунных сывороток.С учетом высокой точности,объек тивности, высокой воспроизводимости и производительности труда при исследовании антимикробной реэистентности организма заявляемый способ рекомен-,Способ определения микробной реэистентности организма путем внесения в пробу цельной крови микробного антигена с последующей оценкой результатов взаимодействия компонентов крови с антигеном, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что, с целью упрощения и повышения точности способа, в пробу цельной крови вносят антиген с избыточной активностью, инкубируют, затем вносят специфические к антигену иммунные антитела, повторно инкубируют с последующим центрифугированием смеси, отделением надосадочной жидкости и определением в ней остаточной активности внесенного антигена в реакции торможения пассивной гемагглютинации.