Способ получения растений-регенерантов кукурузы из культуры тканей

(594 С ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКПРИ ГКНТ СССР НИЯ ИСАЙ ВТОРСН 1-3 ваниюиспольелью ологии культсярацииов- три(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙНЕРА 11 ТОВ КУКУРУЗЫ ИЗ КУЛЬТУРЫ(53) 578.085 СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК РЫТИЯМИЗОБРЕ Ид:ТЕЛЬСТВУ Бюл. В 47,молекулярной биКазССРб и М.К. Карабаев23(088.8) нологии, а именно к культивиротканей растений, и может бытьзовано в селекционной работе.изобретения является увеличенихода растений"регенераитов изтуры тканей, а также повьипениежизнеспособности, что достигаедобавлением в среду для регенеи в среду для укрепления побегпредшественников фитогормоновтофана и аденина. б табл.Изобретение относится к биотехнологии, в частности к биологическим исследованиям сельскохозяйственных растений методом культуры изолиро 5 ванных тканей, и может быть использовано в работе по созданию новых форм растений, в частности сортов и линий кукурузы, обладающих хозяйственно ценными признаками ОНизкий выход регенерантов растений в культуре тканей злаковых явля-., ется одним из лимитирующих факторов для применения клеточных технологий в процессах создания новых сортов растений с хозяйственно ценными признакамиЦелью изобретения является повышение выхода растений-регенерантов и увеличение их жизнеспособности,Способ заключается в том, что при культивировании растений кукурузы в культуре тканей, включающем культивирование эксплантатов на питательной среде, субкультивирование 25 первичных каллусов, отбор морфогенных каллусов и получение в дальнейшем растений-регенерантов,в среду для регенерации растений и в среду для укрепления сформировавшихся побегов добавляют предшественники фитогормонов - триптофан (предшественник ауксина) и аденин (предшественник цитокинина) в определенном соотношении, При этом наличие в сре 35 де предшественников фитогормонов позволяет смещать направленность синтеза эндогенных фитогормонов и дает возможностьболее тонко регулировать морфогенетические процессы в каллусах сообразно физиологическим особенностям каждого генотипа. Способ осуществляется следующимспособом,45Незрелые зародыши (15-20 дн послеопыления) гибридов кукурузы поверхностно стерилизуют в 2%-ном растворехлорамина в течение 20 мин, триждыпромывают в стерильной дистиллированной воде и помещают на среду НбЧу-Вонга, содержащую 1 мг/л тиамина,3% сахарозы, 1% агара, 1 мл/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д),цптком вверх и культивируют при 32+ф С в темноте в течение 2-3 недель,Образовавшиеся каллусы пассируют насвежую питательную среду, каждый 2-3недели,Через 2-3 пассажа среди каллусов отбирают морфогенные двух типов: желтые, плотные, развивающиеся иэ зародышевой оси, или белые, блестящие, плотные, развивающиеся из тканей щитка.Отобранные каллусы переносят на среду регенерации Мб, содержащую 1 мг/л тиамина, 3% сахарозы, 1% агара, 40-60 мг/л триптофана, 1-9 мг/л аденина, 0,1-0,3 мг/л 2,4-Д, и культивируют на свету при 27+1 С при 16-часовом фотопериоде.Через 1-2 недели образовавшиеся побеги переносят на среду Нб, содержащую 1 мг/л тиамина, 3% сахарозы, 1% агара, 10-30 мг/л триптофана и 1-20 мг/л аденина, для укрепления сформировавшихся побегов и культивируют при 16-часовом фотоперыоде при 27+ С.Через неделю укрепившиеся побеги высаживают на среду для укоренения, содержащую половинную концентрацию солей по Юб и 1% сахарозы, 1% агара, и выдерживают на ней в течение недели при 27+1 С и 16-часовом фото- периоде. Укоренившиеся побеги пересаживают в почву и культивируют до стадии зрелости.Получение морфогенных каллусов кукурузы (общее для всех случаев), Незрелые зародьппи 15-20 дн после опыления гибридов кукурузы Днепровский 247, Р, н. 5166 и инбредной линии 0,5445 поверхностностерилизуют в 2%-ном растворе хлорамина в течение 20 мин, трижды промывают в стерильной дистиллированной воде и помещают на среду Нб,Чу-Вонга, содержащую 1 мг/л тиамина, 3% сахароэы, 1% агара, 1 мг/л 2,4-Д, щитком вверх и культивируют при 3211 С в темноте в течение 2-3 недель. Образовавшиеся каллусы пассируют на свежую питательную среду каждые 2-3 недели.Через 2-3 пассажа среди каллусов отбирают морфогениые двух типов: желтые., плотные, развивающиеся из тканей зародышевой оси, или белые, блестящие, плотные, раэвивакщиеся из тканей щитка, Отобранные каллусы переносят на среду регенерации.П р и м е р 1. Полученные морфогенные каллусы пересаживают на среду регенерации Цб, содержащую 1 мг/л тиамина, 3% сахарозы, 1% агара, 40 мг/л триптофана, 1 мг/л аденина, 3 144 0,1 мг/л 2,4-Д, и культивируют на свету при 27 ф 1 С при 16-часовом фото- периоде.Через 1-2 недели формируются листовые зачатки, побеги на некоторых морфогенных каллусах. Частота образования регенерантов зависит от генотипа исходного растения.Процент регенерации растений для различных генотипов кукурузы на среде М 6 с 40 мг/л триптофана, 1 мг/л аденина, 0,1 мг/л 2,4-Д приведен в табл. 1.Таким образом, осуществление способа возможно при использовании в среде регенерации 40 мг/л, триптофана, 1 мг/л аденина и 0,1 мг/л 2,4-Д (нижняя граница заявленного интервала концентраций компонентов),П р и м е р 2. Морфогенные каллусы пересаживают на среду М 6, со" держащуюмг/л тиамина, Зсахарозы, 1 агара, 50 мг/л триптофана, 5 мг/л аденина 0,2 мг/л 2,4-Д, и культивируют на свету при 27 С при 16-часовом фотопериоде.Через 1-2 недели наблюдается формирование зачатков побегов, причем со .значительно большей частотой, чем на среде регенерации (пример 1). Частота регенерационных событий также зависит от генотипа растений доноров эксплантатов.Процент регенерации растений для различных генотипов иа среде М 6 с 50 мг/л триптофана, 5 мг/л аденина и 0,2 мг/л 2,4-Д приведен в табл.2. Таким образом, осуществление способа возможно при использовании в среде регенерации 50 мг/л триптофа- . на, 5 мг/л аденина, 0,2 мг/л 2,4-Д наилучшим образом, с наивысшей частотой регенерации (оптимальные концентрации компонентов).П р и м е р 3. Морфогенные калпусы пересаживают на средУ регенерации М 6, содержащую 1 мг/л тиамина, 3% сахарозы, 1 . агара, 60 мг/л триптоФана, 9 мг/л аденина и 0,3 мг/л 2,4-Д, и культивируют на свету при 27+ С и 16-часовом фотопериоде.Частота формирования зачатков побегов, образующихся через 1-2 недели, снижается для всех тестированных генотипов по сравнению с вариантом с оптимальными. значениями концентраций компонентов. Осуществление способа 61554получения растений-регенерантов изкаллусов возможно при концентрациив среде регенерации М 6 триптофана 560 мг/л, аденина 9 мг/л, 2,4-Д0,3 мг/л (верхняя граница заявленного интервала концентраций компонентов).Процент регенерации растений дляразличных генотипов на среде М 6 с60 мг/л триптофана, 9 мг/л аденинаи 0,3 мг/л 2,4-Д приведен в табл. 3.П р и м е р 4. Изучают влияниеФразличных концентраций триптофана и 5 аденина на регенерацию растений вкультуре каллусов. Концентрацию триптофана в среде М 6 меняют от 20 до80 мг/л, аденина от 0 до 10 мг/л,концентрация 2,4-Д Фиксируется на 20 чровне 0,2 мг/чПри этом показано (табл, 4), чтоиспользование триптофана в концентрации ниже 40 мг/л и выше 60 мг/л, 25 аденина киже 1 мг/л и выше 9 мг/лне приводит к желаемому зффекту -регенерации растений.Данные сведены в табл. 4.30 П р и и е р 5. Зачатки побегов,сформировавшихся на среде регене-,рации, переносят на среду М 6 для укрепления побегов, содержащуюмг/лтиамина, Зсахарозы, 1 агара,10-30 мг/л триптофана, 1-20 мг/ладенина и культивируют на свету при6-часовом фотопериоде при 2711 С.При использовании среды для укреп.пения побегов с добавлением трипто 40 Фана и аденина в укаэанных интервалах концентраций наблюдается болеебыстрый рост растений, увеличиваетсяих высота и диаметр,и, таким образом,повышается жизнеспособность регене 45 рантовВлияние триптофана и аденина всреде для укрепления побегов на жизнеспособность растений-регенерантов,показано в табл, 5,50П р и м е р 6. Изучают влияниеразличных концентраций триптофанаи аденина в среде для укрепленияпобегов на увеличение жизнеспособности регенерантов. Уровни триптофана меняют от 0 до 40 мг/л, уровниаденина - от 0 до 30 мг/л,Результаты исследований приведеныв табл, 6.5 1446155 Т Из табл. 6 видно, что при исполь- зовании концентраций триптофана выше 30 мг/л и аденина выше 20 мг/л наблюдается некоторое угнетение роста побегов. При концентрациях триЯ- тофана ниже 1 О мг/л и аденина ниже 1 мг/л нет заметного увеличения жизнеспособности регенерантов.Через неделю культивирования на среде рпя укрепления побегов регенеранты пересаживают на среду для укоренения, содержащую половинную концентрацию солей по Б 6, 1 Е сахарозы, 1 Х агара, и выдерживают на ней в течение недели при 27 ф 1 С и 16-часовом фотопериоде. Укоренившиеся побеги .переносят в почву и культивируют до стадии зрелости. Генотип Побегообразование, 7 ГибридыДнепровский247 15,1 Р 10 и 5166 4,2 3,5 Инбреднаялиния 05445 1,0 15Таблица 2 Генотип Побегообразование, 7. 20 ГибридыФормула изобретения 58,3 Днепровский 247 Способ получения растений-регенерантов кукурузы из культуры тканей, включающий культивирование первичных эксплантатов на питательной среде И 6 Чу Вонга, субкультивирование первичных каллусов, отбор морфогенных каллусов и получение из них регенерантов, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода растений-регенерантов и увеличения их жизнеспособности, в питательную среду для регенерации добавляют трип тофан в концентрации 40-60 мг/л, аденин в концентрации 1-9 мг/л и 2,4-Д в концентрации 0,1-03 мг/л, а в среду для укрепления побегов добавляют. триптофан в концентрации 10-30 мг/л и аденин в концентрации 1-20 мг/л. Р2 я н 5166н 516 Инбредная линия0 05445 Таблиц нерация, Х для геноомпоненты с Рег тип мг 5166 РДнепровский 247 риптоан енин О О 0 0 О 0 О 5 О 8,3.Трипт 445 Днепровский 247 енин О О 0 0 О 0 О аблица ость побег омпоненты среды,г/л Гибрид Диамемм Высота,см риптофан Аден Без добаво10 Днепров кий 247 1,2-1,5-1 1, 0-1 2, 5-3,0-3,0 2 1,5-2,О Без добавок,2-2,5 20 Табл омпоненты средыг/л ощность побега Диаметрмм Триптофан Аденин Высота,см Без добавок О 0-1,Хомпонентц средц,мг/л 1-1,5 1, 0-1,6 1,2-1,7 1,3-1,8 2,0"3,0 1,5-2,5Заказ 7566 Тираж 520 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5