Способ определения метотрексата

(21) (22) (46) 1 са 1 988,ий т и избирательл аз ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОбРЕТЕНИЯМ И ОТНЯТИЯПРИ П(КТ СССР . ОПИСАНИ ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ 4037 228/28-0414,03,8623,03.90, Бюл. В 13(71) Курский государственный медицинский институт(56) Е 11 ахйЬу М.М., Е 1-Таггаз М Тайгоз Н.В., Ашег М.М. - Апа 1 уй згийу оЕ шегЬоггехе, Апа 1 уй 1 са 1 1,еегз, 1982, В 15, Б 11, 981 Юденфренд С. Флуориметрическ анализ в биологии и медицине, М,: Химия, 1965, с. 394,(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТОТРЕКСАТ (57) Изобретение относится к аналитической химии, в частности к опред Изобретение относится к облас и аналитической химии, а именно к способам определения метотрексата (дезокси-амино-М -метилфолиевая кисло"Юта), и может быть использовано для идентификации данного соединения в лекарственных средствах с целью контроля их качества и количественного определения в воздухе производственных помещений при санитарном контроле и биологических жидкостях организма при фармакокинетических исследованиях,Целью изобретения является повьппение чувствительностиности определения,Способ осуществляю лению метотрексата (дезокси-аминоюБ -метилфолиевая кислота), и может быть использовано для идентификации данного соединения в лекарственных средствах. Цель - повьппение чувствительности и избирательности определе ния. Определение метотрексата ведут обработкой раствора анализируемого вещества химическими реагентами (ХР) с последующим измерением интенсивнос ти Флуоресценции полученного раствора, Обработку проводят ХР последовательно 257-ным раствором гидроксида аммония, 57-ным раствором хлората .,калия и концентрированной НС 1 при их объемном соотношении 1;1:(7-8):(0,8- 0,9), Способ в 10 раз более чувствителен и обладает более высокой избирательностью, 8 табл. К 1 мл раствора метотрексата в О,1 н, растворе гидроокиси натрия прибавляют 1 мл 25%-ного раствора гидроокиси аммония, 7,2 мл 57-ного раствора хлората калия и 0,8 мл концентрированной соляной кислоты (35-.38%-ной), Измеряют интенсивность флуоресценции полученного раствора относительно стандартного раствора с известным содержанием метотрексата. Зависимости интенсивности флуоресценции от количества 5%-ного раствора хлората калия и от количества концентрированной (35-387-ной) соляной кислоты приведены в табл.1 и 2 соответственно,Количества реактивов выбраны с учетом их максимальной растворимостии длительности флуоресценции: 1 мл257-ного раствора гидроокиси аммония,7,2 мл 57-ного раствора хлората калия (см.табл,1, это количество оптимально также с учетом количествавсех остальных реактивов и для создания постоянного объема для проведения реакции . - 10 мл) и 0,8 мл концентрированной соляной кислоты (35- О38%-ной) (см.табл.2) Использованиезапредельных количеств реактивов непозволяет достигнуть цели изобретения (см.табл.1 и 2),Данные о флуоресценции родственных 15соединений приведены в табл.З. Данныепо зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации метотрексата (калибровочный график) приведены втабл.4, Линейная зависимость между 10концентрацией метотрексата и интенсивиостью флуоресценции наблюдается впределах 0,001-8 мкг/мл.Чувствительность определения со",ставляет 0,001 мкг/мл метотрексата. 25Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации метотрексата(калибровочный график) приведена втабл,4, Интенсивность флуоресценциисохраняется в течение 24 ч, 30П р и м е р 1, Качественное определение метотрексата.К крупинке порошка метотрексатаили мелкоизмельченных таблеток прибавляют 1 мл 0,1 н, раствора гидроокиси натрия, встряхивают, прибавляют 1 мл 25%-ного раствора гидроокиси аммония, 7,2 мл 57-ного растворахлората калия. Перемешивают и добав"ляют 0,8 мл концентрированной соля" 40ной кислоты (35-387.-ной) Наблюдаютярко-голубую флуоресценцию при облу"чении раствора ультрафиолетовым светом с длиной волны 365 нм, Флуорес"ценция указывает на содержание в 45исследуемой пробе метотрексата.П р и м е р 2. Количественное определение метотрексата в крови (искусственная смесь).К 1 мл крови, содержащей 1 мкг пре парата, прибавляют 4 мл 0,83%-ногораствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и центрифугируют 1-2 с.Затем в пробирку добавляют 30 мл на"сыщенного водой н-бутанола и после551 О мин смешивания центрифугируют30 мин,25 мл (аликвотная часть) органической фазы переносят в другую пробирку, добавляют 10 мл гексана и 0,02 мл 6 н. раствора гидроксида натрия, 2,5 мл дистиллированной воды переме" шивают 5 мин и центрифугируют 3-4 мин, Органическая фаза удаляется. К водной фазе прибавляют 0,1 мл 507-ного раствора трихлоруксусной кислоты и 30 мл смеси гексанхлороформ в соотношении 2:1 и смешивают в течение 10 мин с последующим центрифугированием. Органическую фазу удаляют. К водной фазе прибавляют 30 мл смеси этилового эфира - хлороформа в соотношении 3:1, Смешивают в течение 10 мин и центрифугируют. Органическую фазу удаля" ют.К 1 мл (аликвотная часть) водной фазы прибавляют 1 мл 257.-ного раствора гидроксида аммония, 72 мл 5%- ного раствора хлората калия и 0,8 мл концентрированной соляной кислоты (35-38%-ной)Измеряют интенсивность флуоресценции исследуемого, стандартного и контрольного растворов на электрофлуориметре ЗФ-З,МА, Концентрацию метотрексата в крови (Х) в мкг/мл вычисляют по формуле п 1- иоХ = -- -С 3,5,и - ий огде п - интенсивность флуоресценцииисследуемого раствора;и - интенсивность флуоресценциистандартного раствора;и - интенсивность флуоресценцииконтрольного раствораС - концентрация стандартногораствора метотрексата,мкг/мл;3,5 - коэффициент разведенияПриготовление стандартного раствора.50 мг метотрексата (точная навеска) переносят в мерную колбу на 50 мл,прибавляют 0,1 н, раствор гидроксиданатрия, растворяют, доводят объемдо метки. 1 мл полученного растворапереносят в мерную колбу на 2000 мли доводят объем до метки дистиллированной водой. Концентрация раствора0,5 мкг/мл.1 мл полученного раствора перено-сят в пробирку, добавляют 1 мл 25%ного раствора гидроксида аммония,7,2 мл 57-ного раствора хлората калия и 0,8 мл концентрированной соля"ной кислоты (35"38%-ной), Концентра"ция раствора 0,05 мкг/мл, 1438 21Результаты определения приведеныв табл,б. К 1 мл (аликвотная часть) водной Фазы прибавляют 1 мл 25%-ного раствора гндроксида аммония, 7,2 мл 5%- ного раствора хлората калия и 0,8 мл концентрированной соляной кислоты (35-38%-ной), Измеряют интенсивность Флуоресценции исследуемого, стандартного и контрольного растворов на электрофлуориметре ЭФ"3 МА. Концентрацию метотрексата в биологической жидкости (Х) в мкг/мл вычисляют по формуле и 1 ио- С 3,5 и - ио- интенсивность Флуоресценцииконтрольного раствора;- интенсивность Флуоресценциистандартного раствора;- концентрация стандартногораствора метотрексата,мкг/мл;- коэффициент разведения,где и,ио П р и м е р 3. Количественное определение метотрексата в моче искусственная смесь).К 1 мл мочи, содержащей 10 мкг препарата, прибавляют 4 мл 0,83%-но-. го раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и центрифугируют 1-2 с. Затем в эту пробирку добавляют 30 мл насыщенного водой н-бутанола и после 1 О мин смешивания центрифугируют 30 мин.25 мл (аликвотная часть) органической фазы переносят в другую пробирку и добавляют 1 О мл гексана и 0,002 мл 6 н. раствора гидроксица натрия, 2,5 мл дистиллированной воды, перемешивают 5 мин и центрифугируют.3-4 мин. Органическая Фаза удаляется. К водной фазе прибавляют 0,.1 мл 50%-ного раствора трихлоруксусной кислоты и 30 мл смеси гексан - хлоро" Форм в соотношении 2:1 и смешивают в течение 10 мин с последующим центрифугированнем. Органическую фазу удаляют. К водной фазе прибавляют 30 мл смеси этилового эфира - хлороформа в соотношении 3:1. Смешивают в течение 10 мин и центрифугируют, Органическую фазу удаляют. Для опрецеления используется стандартный раствор с концентрацией0,5 мкг/мл.Результаты определения приведеныв табл.7,В табл.8 приведена зависимость интенсивности Флуоресценции от соотношения используемых реактивов,,0 П р и м е р 4, Количественноеопределение метотрексата в воздухерабочей зоны промышленных предприятий.Исследуемый воздух со скоростью15 2 л/мнн в течение 10 мин просасывают через два последовательно соединен"ных ноглотительных прибора Зайцева,содержащих по 5 мл 0,1 н, растворагидроокиси натрия,Содержимое поглотительных приборовобъединяют, 1 мл полученного растворапереносят в пробирку, добавляют 1 ип25%-ного раствора гидроокиси аммония,7,2 мл 5%-ного раствора хлората калия25 и 0,8 мл концентрированной солянойккслоты (35-38%-ной). Измеряют интенсивность флуоресценции исследуемого,стандартного иконтрольного растворов.30 Концентрацию метотрексата, в воздухе рабочей зоны (Х) в мг/мл вьгчисляют по ФормулеА В С 7,35где А - количество метотрексата найденное в анализируемом объеме 1 мл поглотительного раствора, мкг;40 В - объем поглотительного раствора, мл;С - объем поглотительного раствора взятого для анализа,мл;45 7, - объем воздуха, отобранногодля анализа приведенный кстандартным условиям,Количество метотрексата в анализируемом объеме 1 мл поглотительногоЫ раствора А в мкг вычисляют по Форму.леи - и,и "игде Й - количество метотрексата в55 стандартном растворе взяВтом для проведения реакции(1 мл), мкг;и - показания Флуориметра дляисследуемого раствора;1438421 Таблица 1 Количество хлората калия, мл Интенсивность флуоресценции, 7. 1 28 2 38 3 44 4 52 5 62 б 68 7 70 8 УО 9 68 10 66 Таблица 2 Количество соля- Интенсивность флуоной кислоты, мл ресценции, 7.,Таблица 3 Способ Соединение предлагаемый известный Фиолетовая флуо- Нет флуорес"ресценция ценцииФлуоресценции Флуоресценциинет нет Фолиевая кислота П-аминобензоил" глутаминовая кислотаГлутаминовая кислотаПтеридин незамещенныйТриамтеренеюВ 11 и - показания флуориметра длястандартного раствора;и - показания флуориметра дляконтрольного раствора,При больших концентрациях метотрексата в воздухе исследуемый раствор подвергают разбавлению и расчет концентрации метотрексата Х вычисляют с учетом разведения, ОПо сравнению с известным, описыва" емый способ в 10 раз более чувствителен и, обладает более высокой избиратель- ностью 1Формула изобретения Способ определения метотрексатапутем обработки раствора анализируемого вещества химическими реагентамнс последующим измерением интенсивности флуоресценции полученного раст" вора, о.т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью повышения чувствительности и избирательности определения, 25обработку проводят последовательно25%-ным раствором гидроксида аммония,5%-ным раствором хлората калия иконцентрированной соляной кислотойпри объемном соотношении анализируе-.мой пробы, 25%-ного раствора гидроксида аммония, 57-ного раствора хлората калия и концентрированной соляной кислоты 1:1:(7-8):(0,8-0,9) соответственно,35 0,1 0,2 0 3 0,4 0,7 0,8 0,9 1 О 20 22 28 34 50 58 60 65 63 О143842 Таблица 4 1еюиввм ешет м щ цаеейеееюп ш аввем Интенсивность флуоресценции, Й Концентрация метотрексата, мкг/мл0,1 0,01 0,001 2 0,2 0,02 0,002 3 0,3 0,03 0,003 4 0,4 0,04 0,004 5 0,5 0,05 0,005 б 0,6 0,06 0.006 7 0,7 0,07 0,007 8 0,8 0,08 0,008 9 Ор 9 0 09 0,009 О 1,0 0,10 0,010 Таблица 5 Время, ч Интенсивность флу"оресценции, % Таблица 6 Содержание препарата в 1 мл, мкг Определено, Метрологические мкг данные Х = 0,92Б = 0018оч Оф 018+О, 018А = ф 1,8 Х 10 1,0 1,0 1,0 0,91 0,89 0,92 0,94 0,93 1,О 0,93 Т а б л и ц а 7 1 Метрологические данные Определено, мкг Содержание препарата в 1.мл,мкг Х = 9,05Б = 0,187Вх ф Ое 084Е о,ч = Ое 305Х +Е 0 щ =.9 05 фО, 205А = 12,05 10,0 10,0 1 О,О 10,0 10,0 10,0 1 2 3 4 5.24 48 72 88 9,1 9,0 9,2 8,9 9,3 1 О 16 24 30 35 40 52 64 76 80 80 80 80 80 80 80 65 48 10 16 22 30 35 45 56 64 78 90 18 26 38 48 54 60 66 72 80 90 24 30 38 44 54 62 68 72 82 901438421 Таблица 8 Интенсивность флуоресценции, 7, при содержании препарата в 1 мл раствора, мкг 1 О,ОО 0,01 0,1 О, 8,0 Составитель Л,РусановаРедактор Х,Самерханова Техред И,Ходанич Корректор О,Кравцова,Заказ 997 Тираж 510 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 1 1 303 5 р Москва у Ж 35, Раушская наб д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.уигород, ул. Гагарина,101 Соотношения реактивов гидроксидааммония, хлоратакалия и сернойкислоты 0,5:7,7:О 8 1,0:7,2:0,8 1,О:7,10,9 1,0 й 6,9 з 1,1 1 2 Ф 7 2:0,6 5 90 90 1 О 40 6 90 91 10 385 6 5 90 92 92 90 92 90 8 12 1 О 42 42 40