Способ количественного определения углеводородов в биологических объектах

,133 19 01 И 33/О Т СССРОТКРЫТИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМ ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИИ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН С 8 ИДЕТЕЛЬСТВ ВТОРСК а ( дов и отдел(71) Институт питания АМН СССР (72) Т.М.Ушакова, Л,Ш,Воробьева и О.Н,Чернышева(56) Авторское свидетельство СССР У 175731, кл. С 12 Я 1/00, 1964.Авторское свидетельство СССР У 175728, кл, С 12 (1 1/00, 1964.Сгдпппег С., Б,Н.ВоЬп 1 е,Епчггопшепга 1 сагс 1 пяепя яе 1 есгег 1 шегггодя оЕ апо 1 уя 1 я. Еяап 1 АКС рцЫ 1 саТгоп 1 уоп 1979, ч.З, ес 1.4 р.129.(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ УГЛЕВОДОРОДОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ(57) Изобретение относится к пище-. вой и микробиологической промьшлен ности и может быть использовано дл определения углеводородов в пищевых продуктах и продуктах микробиологи ческого анализа, Целью изобретения является расширение возможностей с соба путем определения различных классов углеводородов, а именно ал фатических и циклоалифатических уг леводородов моноциклических арома тических и бициклических ароматиче ких углеводородов, а также трицикл ческих ароматических и полициклических ароматических углеводородов,Берут образец биоматериала, разрушаютего щелочным гидролизом, неомыляемыелипиды экстрагируют неполярным растворителем, затем подвергают хроматографическому разделению на колонкес активированным силикагелем, Приэтом выделяют две фракции: первуюэлюируют гексаном вторую - смесьюгексана и диэтилового эфир 9:1).Для концентрирования полициклическихароматических углеводоро е ния переходных примесеи проводят жидкость-жидкостное распределенгге 2-йгругпы соединений в системе диметилформамид - вода - гексан (9:1:О) ипоследующее хроматографическое разделение выделенной смеси в тонком слоеацетилированной целлюлозы (системаэтанол - ацетон - вода 60:25:15),Хроматографическое разделение 1 фракции проводят в тонком слое окиси алюминия с выделением зон, содержащихалифатические и циклоалифатическиеуглеводороды, моноциклические арены,бицикличеСкие арены, Идентификациюи количественное определение выделенных соединений проводят с помощью гаэожидкостной и Уф-спектрофотометрии,4 таблИзобретение относится к пищевойи микробиологической промышленности и может быть использовано для определения углеводородов в пищевых продуктах и продуктах микробиологического синтеза,Целью изобретения является расширение возможностей способа путем определения различных классов углеводородов, а именно алифатических и циклоалифатических углеводородов, моно- циклических ароматических и бициклических ароматических углеводородов, а также трициклических ароматических и полициклических ароматических угленодородон, Способ осуществляют следующим образом.20Исследуемый образец биоматериала разрушают с помощью щелочного гидро- лиза, неомыляемые липиды экстрагируют неполярным растворителем и поднер 25 гают хроматографическому разделению на колонке, заполненной активированным силикагелем, выделяя при этом две фракции: первую элюируют гексаном - она содержит алифатические и циклоалифатические углеводороды, моно- и бициклические ароматические углеводороды (арены); вторую фракцию элюируют смесью гексана и диэтилоного эфира (9:1) - она содержит трии полициклические арены) а также ряд 35 природных соединений., затрудняющих определение аренов, и том числе сквален (природные смеси), Для того, чтобы сконцентрировать полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) и 4" отделить природные примеси, проводятжидкость-жидкостное распределение 2-группы соединений в системе диметилформамид (ДМФ) - вода - гексан (91 : 10) и последующее хроматогра фическое разделение вьделенной смеси в тонком слое ацетилированной целлюлозы (система - этанол - ацетонвода 60;25:15). Хроматографическое разделение 1-й фракции проводят в тонком слое окиси алюминия, ньделяя зоны, содержащие алифатические и циклоалифатические углеводороды, моноциклические арены, бициклические арены,55Идентификацию и количественное определение вьделенных соединений проводят с помощью газожидкостной (ГХ) и УФ-спектрофотометрии,П р и м е р 1, Определение модельной смеси углеводородов, добанленнойк свиному салуфК образцу сала (200 г) добавляютмодельную смесь соединений (см.табл.1). Материал гидролиэуют в600 мл 1,511 раствора КОН в смеси этанол: вода (9:1) в течение 3-х ч прикипении рас) )ра. Неомыляемые липидыэкстрагирую. )з реакционной массыгексаном (Зх 150 мл) после разбавления ее 600 мл воды, Экстракт промывают водой, сушат сульфатом натрияи упаривают до объема 1-2 мл,Хроматографическое разделениеэкстракта проводят на колонке, заполненной 15 г силикагеля, предварительно промытого хлороформом и акотивированного при 200 С в течение4 ч, Элюируют первую фракцию 80 млгексана, вторую фракцию - 100 мл смеси гексана и диэтилового эфира (9:1) .Первую фракцию подвергают хроматографическому разделению в тонкомслое окиси алюминия 1-й степени активности в системе гексан на стеклянных пластинах 20 х 20 см. Проявляютхроматографические эоны в парах иода,Собирают зоны алифатических и циклоалифатических углеводородов (К 0,91,О), моноциклических аренон Я 0,70,8), бициклических аренов (К 0,50,6),Для того, чтобы устранить возможные ошибки, связанные с колебаниямихроматографической подвижности исследуемых углеводородон, с края хроматографической пластины наносят в точкусмесь реперных соединений (н-алкан,гептадецилбензол, нафталин), отделяяэту часть пластины сплошной полосой,Фракции элюируют с сорбента смесьюгексана и диэтилового эфира, растворитель упаривают, вьделенные соединения анализируют с помощью ГХ.Вторую фракцию, н состав которойвходят три- и полициклические арены,а также ряд природных соединений, втом числе сквален, упаривают досуха,растворяют в 100 мл гексана и экстрагируют трижды смесью Р 1 Ф - вода (9:1)по 100 мл. ДМФ-слой разбавляют 300 млводы и экстрагируют гексаном (3 хх 100 мл) . Экстракт промывают водойи сушат сульфатом натрия, растворитель упаринают до 1-2 мл, Хроматографируют экстракт в тонком слое ацетилированной (30;);) целлюлозы в хрома 1337764тографической системе этанол - ацетон - вода (60:25:15) на пластине13 х 18 см, Хроматографические эоны обнаруживают при облучении пластиныУФ-светом (Ънм) по их флуоресценции, Используют также реперныесоединения фенантрен, бенз(а)антрацен, бенз(р)хризен, бенз(Е)пирен).Собирают соответствующие зоны и анализируют фракции с помощью ГХ,Условия ГХ:стеклянный капилляр(1 = 50 м, й = 0,25 мм) ОЧ, пламенно-ионизационный детектор (ПИД),газ-носитель - азот, скорость2 мл/мин, программирование темпераФотуры от 150 до 300 С со скоростьюЭ /мин,Результаты определения модельнойсмеси углеводородов, добавленной кобразцу свиного сала, по способу-прототипу и предлагаемому способу приведены в табл Как видно из приведенного сравнения, изобретение обеспечивает вьделение и определение соединений какалифатического, так и ароматическогорядов, включая ПАУ, В то же времяспособ-прототип позволяет определитьтолько ПАУ с числом циклов 4 и более,трициклические арены (фенантрен) определяются не количественно (выделено 307).П р и м е р 2. Модельную смесьуглеводородов, включающую 1 О мг эйкозана, 5 мг гептадецилбензола, 5 мгдиметилнафталина, 2 мг фенантрена,.2 мг бенэ(а)антрацена, 2 мгбенз(е)пирена и 2 мг бензхризена,растворяют в 00 мл гексана и экстрагируют 100 мл смеси ДМФ - вода (9:1).ДМФ-слой разбавляют водой (1:1) иэкстрагируют 100 мл гексана,Гексановый экстракт промывают водой, упаривают до объема 500 мл ианализируют с помощью ГХ на стеклянном капилляре с ОЧ, детектор -ПИД при программировании температуоры от 150 до 300 /мин, газ-носительазот, скорость 1,2 мл/мин.Результаты примера 2 приведеныв табл.2,Иэ табл.2 видно, что распределение в бинарной системе ДМФ-Н 0 /гексан позволяет достаточно селективно разделить алифатические и полициклические углеводороды с числом циклов 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 4 и более, Для аренов с числом циклов 1-2 это распределение значительно менее селективно и связано с потерями анализируемых соединений как в гексановом, так и в ДМФ-слое. Очевидно; что переэкстракция неомыляемых липидов, проводимая в способе- прототипе перед хроматографическим разделением последней, приводит к потерям моно- и бициклических аренов и не дает возможности количественного их определения. В то же время жидкость-жидкостное распределение в этой системе позволяет отделить от ПАУ ряд природных соединений, совпадающих с ними по хроматографической подвижности, и является существенным этапом в вьделении и концентрировании три- и полициклических аренов. Поэтому эта стадия введена в предлагаемую схему анализа после хроматографического вьделения из неомыляемых липидов суммы алифатических, циклоалифатических, моно- и бициклических ароматических углеводородов,П р и м е р 3, Определение углеводородного состава тканей крыс, в корм которых добавляли дизельное топливо (ДТ) в количестве 50 и 400 мг/кг массы животногоСогласно предлагаемому способу определяют основные компоненты дизельного топлива в тканях крыс контрольной и опытных групп. Определение алифатических и циклоалифатических углеводородов осуществляют с помощью ГХ по методу внутреннего стандартаУсловия ГХ описаны в примере 1. Результаты определения аренов получены на основании анализа УФ-спектров растворов соответствующих фракций.В табл. Э и 4 представлены полученные данные о содержании алифатических, циклоалифатических и ароматических углеводородов в тканях крыс контрольной и опытных групп.Разработанные условия колоночной хроматографии позволяют селективно разделить укаэанные две группы соединений, а также отделить от первой группы углеводородов природный полиеновый изопреноид - сквален, присутствие которого затрудняет определение бициклических аренов.Как показали предварительные эксперименты, четкое отделение скваленв достигается только при использовании активированного (полностью обезвожен 133776415 20 25 ного) при 200 "С силикагеля. Элюирование фракций последовательно гексаном и смесью гексана и диэтилоного эфира (9:1) обеспечивает минимальное перекрывание хроматографических зон первой и второй фракций, что позволяет избежать потерь определяемых соединений и повысить точность анализа.Соотношение гексана и диэтилового эфира 9:1 (по объему) является оптимальным и обеспечивает полноту элюирования полициклических аренон с числом конденсированных циклов до 7 и в то же время приводит к минимальному загрязнению второй фракции природными примесями, Иеньшее количество диэтилоного эфира в смеси значительно повышает объем элюата большее приводит к перегрузке выделенной фракции примесями, что затрудняет последушщее хроматографическое ее разделение в тонком слое ацетилированной целлюлозы.Проведение хроматографического разделения первой фракции н тонком слое окиси алюминия позволяет вьделить сумму алифатических и циклоалифатических углеводородов, а также отдельно моно- и бициклические арены.Жидкость-жидкостное распределение второй группы соединений в системе Д 1 Ф - вода/ гексан дает возможность значительно сконцентрироватьследовые количества три- и полициклических аренон и отделить ряд примесей природного характера, мешающихих дальнейшему определению. Трехкратная переэкстракция в системе д,"иввода/гексан значительно увеличиваетстепень извлечения ПАУ.Тонкослойная хроматография (ТСК)на ацетилированной целлюлозе, полученной ныше смеси соединений, позволяет вьделить узкие фракции три- иполициклических аренов и н то жевремя отделить следовые примеси неуглеводородного характера,Применение реперных соединенийпри ТСХ обеспечивает четкое выделение исследуемых групп углеводородови устраняет возможные ошибки, связанные с изменением хроматографическойподвижности этих соединений,Изобретение дает возможность расширить возможности способа путемопределения различных классов углеводородов, позволяет достигнуть полно 30 35 40 45 50 55 ты извлечения исследуемых углеводородон, высокой селективности разделения их на группы, а также произвести достаточно полное отделение примесей природного характера, что позволяет с большой точностью и надежностью определять следовые количества алифатических, циклоалифатических и ароматических соединений, дифференцировать смеси природных угленодородон и загрязняющих биоматериал нефтяных угленодородон.Изобретение не требует дефицитного оборудования и материалов и может быть использовано в лаборатории химического и биохимического профиля при анализе различных биологических объектов, н частности при гигиенической характеристике продуктов питания и продуктон микробиологического синтеза для определения загрязнения их углеводородами нефти,Формула изобретения1. Способ количественного определения углеводородов н биологических объектах, включающий отбор образца, гидролиз водно-спиртовым раствором щелочи, экстракцию неомыляемых липидов, жидкость-жидкостное их распределение в системе диметилформамид нода - гексам, колоночную хроматографию на силикагеле, ньделение углеводородов с количественным определением последних, о т л и ч а ю щ и й - с я тем, что, с целью расширения возможностей способа путем определения различных классов углеводородов, колоночную хроматографию проводят перед жидкость-жидкостным распределением, причем для хроматографии используют активированный силикагель и ньделяют две фракции, первую нз которых элюируют гексаном, вторую - смесью гексана и диэтилового эфира в объемном соотношении 9:1, а жидкость-жидкостному распределению подвергают вторую фракцию, при этом выделение углеводородов из любой фракции проводят с помощью тонкослойной хроматографии.2. Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что алифатические и циклоалифатические углеводороды, моноциклические ароматические и бициклические ароматические углеводороды вьделяют раздельно из первой фрак1337764 ции, при этом тонкослойную хроматографию проводят на окиси алюминия, трициклические ароматические и поли- циклические ароматические углеводороТаблица 1 Выделено Соединение Добавленок образцу,мг по способу-пропо предлагаемому способу тотипу мг Е мг 9,70 97 10,00 Эйкозан Гептадецилбензол 1,85 92 2,0 Диметилнафталин 1,82 91 2,0030 95 0,95 0,30 1,00 фенантрен Бенз(о)антрацен 94 0,47 86 0,43 0,5 92 0,46 0,46 92 БенэхризенБенэ(е)пирен 0,5 0,48 96 90 0,45 0,5 Таблица 2 Соединение Взято на Выделено, Степень экстрак- мг иэвлечецию, мг ния, Е 10 О,Эккозан Гептадецилбенэол 0,4 1,2 24,0 1,3 65 1,6 80 1 э 7 85 1,8 90 ДиметилнафталинФенантренБенэ(а)антраценБензхриэенБенз(е)пирен ды вьщеляют раздельно иэ второй фракции, при этом тонкослойную хроматографию проводят на ацетилированнойцеллюлозе,1337764 ТаблицаСодержание алифатических н циклоалнфатнческих углеводородовв органах н тканях крыс, получавших неФтяные днстиллатыдизельное топливо) с кормом (в мг/кг массы биоматернала) Доэа нефтяных дистипла тов 400 мг/кг о за нефтяных дис тиллатов 50 мг/кг Контроль Образ риала Сумма став Фракции УВ, Х умма Состав фракци В УВ, 7-С С, -С 91,9 8,Жироваяткань 57,5 42,5 29 242 2,Пече 68,9 2 668,7 787 21 19,7 6 66,Э,1,0 89,0 1 0,3 9,7 Табл оматических углеводородо ДТ) в тканях крыс (в мг/ ефтяныхбиомабраз иома одержание арено ериа оцикличес ициклическ трициклически Добавка ДТ, мг бавка Д г кг 0 40 Жироваяткань 90 5 2,Печень,04 Моз оставитель И.Кутукова ехред И,Попович Корре Редактор Е.Копча Бутяга аказ 4123 41 д4 шская на Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул.Проектная,ПочкиЛегкие умма Состав фракглево- ции УВ, ХородовУВ) С, -С С Содержаниедистиллатотериала) обавка ДТ, мг/к 50 400 Тираж 776НИИПИ Государственного по делам изобретений и 13035, Москва, Ж, Р Подпиомитета СССРткрытий