Способ получения ферментированных спиртовых напитков

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 4 С 12 С 1/О 1)4 С 12 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ ЗОБРЕТЕ АТ(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНЫХ СПИРТОВЫХ НАПИТКОВ(57) Изобретение относится кной промышленности и может на родил ьвти(71) Де форенеде Бри(72) Свен Эрик ГодтфрИартин Оттесен и БентЛарсен (РК)(56) Патент США У 31опублик. 1964,применение в пивоваренной, спиртовойи винодельческой промышленности,Целью изобретения является снижениесодержания диацетила. Сусло, используемое для получения пива или этанола, или виноградный сок подвергаютферментации дрожжами с последующимего созреванием, В процессе ферментации или после нее, или в процессесозревания вводят фермент, превращающий ацетолактат. В качестве ферментиспользуют ацетолактатдекарбоксилазуили изомеразу, или редуктоизомеразу.Фермент и дрожжи используют в иммобилизованном виде. Ацетолактатдекарбоксилазу используют в химически модифицированном виде для обеспечениястабильности и/или активности ее призначении рН среды 4-5. 3 з.п. ф-лы.13030Изобретение относится к бродильной промышленности и может найти применение в пивоваренной, спиртовой и винодельческой промышленности.Цель изобретения - снижение содержания диацетила.Способ осуществляют следующим образом.Сусло, содержащее углеводы, подвергают ферментации дрожжами и созре О ванию. Если сусло или виноградный сок ферментируют с помощью дрожжей или других микроорганизмов, помимо спиртовой ферментации происходят различные процессы, которые мо 6"ут выз вать образование нежелательных побочных продуктов, Примером является об - разование диацетила, который обладает сильным и неприятным запахом даже в очень малых концентрациях, при 20 этом спиртовые напитки, например пиво или вино, могут приобрести неприемлемый вкус и аромат, если содержание диацетила превышает допустимую его концентрацию. 25Образование диацетила невыгодно также в промышленнных процессах производства этанола, так как путем перегонки очень трудно отделить диацетил от этанола, Проблема возникает 30 при получении абсолютированного этанола, если этанол дегидрагируют азеотропной перегонкой с бензолом, Диацетил при этом накапливается в бензольной фазе во время азеотропной 33перегонки, что может привести к образованию смесей диацетила и бенз ла,которые затрудняют регенерацию бе:; -зола, использованного для аэеотропной перегонки,Варка пива включает ферментациюсусла прдходящим видом дрожжей, например, Бассйагошусез сегеч.зае илиБасспагошусез саг 1 зйегепзгз.ферментацию ведут в две стадии:основная ферментация, которая длится7-10 дн и вторичная ферментацияпроцесс созревания, который можетдлиться 3-12 нед. Во время основнойферментации большая часть углеводовв сусле превращается в этанол и двуокись углерода. Созревание проводятпри низких температурах в присутствии небольшого остаточного количества дрожжей. Целью созревания является осаждение нежелательных высокомолекулярных соединений и превращение диацетила, 2,3-пентадиона,Ы-ацетолактата и -ацето-Ф-оксибутирата в такие соединения, как диоды,которые не изменяют запаха и вкуса,Например, бутандиол - конечный продукт превращения Ы -ацетолактата идиацетила в пиве - не влияет на вкуси запах в концентрациях ниже 500 г/л,ферментные и химические реакции важные для содержания в пиве диацетила можно проиллюстрировать на следующей схеме:3 1303Предшественник диацетила Ы -ацетолактат вырабатывается в ферментирующих дрожжах за счет катализируемой ферментом конденсации пирувата и тиаминпирофосфата ацетальдегида и является промежуточным соединением в биосинтезе аминокислоты валина, о-Ацетолактат может таже самопроизвольно разлагаться через окислительное декарбоксилирование до образования ди ацетила, реакция (1), который затем восстанавливается редуктазами в клетках дрожжей во время процесса вызревания пива. Декарбоксилирование с-ацетолактата является реакцией, 15 которая зависит от температуры и протекает относительно медленно при низких температурах, тогда как последуюшее превращение диацетила в ацетоин и 2,3-бутандищ происходит отно сительно быстро, вследствие чего стадией, определяющей скорость удаления сацетолактата и диацетила из пива, является декарбоксилирование диацетильного предшественника. Аналогично стадией, определяющей скорость удаления 2,3-пентандиола и К-ацето- -Д;аксибутирата, является спонтанное декарбоксилирование 2,3-пентандионового предшественника, 30Для достижения максимального осаждения высокомолекулярных продуктов и получения пива хорошего качества вызревание должно происходить при наиболее возможно низких температурах35 например О С. При этойтемпературе оно может происходить несколько месяцев, прежде чем полностью удалится ацетолактат, и образовавшийся диацетил восстановится дрожжами, Однако время 40 вызревания можно уменьшить, если предоставить возможность процессу протекать при более высоких температурах, например, до 1-2 нед прио О10 С, или 1-2 нед при 5 С или 1 или 2 нед - 45 при -1"С. Такая процедура ускоряет превращение ацетолактата в диацетил.Медленного разложения ацетолактата до диацетила, реакция (1) на схеме можно избежать, используя для разло жения ацетолактата ферменты. Для этой цели можно использовать любые ферменты, Все сводится к декарбоксилированию ацетолактата до ацетона, реакция (4). 55 Целесообразно осуществлять превращение ацетолактата в-кето-р- -оксиизовалерат с помощью изомеразы,033реакция (6), или превращение ацетолактата в с,-оксиизовалерат с помощью редукто-изомеразы, реакция (5).Продукты реакции в обоих случаях являются предшественниками аминокислоты валина. Сусло обрабатывают ферментом,превращающим ацетолактат во времянли после ферментации. Примером фер-,мента является ацетолактатдекарбоксилаза, которую можно выделить из микроорганизма АегоЬасгег аегоцепез,Ацетолактат ферментативно декарбоксилируют до ацетоина, в результатеудается избежать образования сильнопахнущего нежелательного диацетилаиз ацетолактата. Разложение с -аце"толактата до диацетила удается избежать за счет превращения предшественника диацетила с помощью ацетолактатных редукто-изомераз или изомераз,реакции (5) и (6).Ацетолактатдекарбоксилазу можнодобавлять во время основной ферментации или во время процесса созревания. Применение этого фермента приводит к значительному сокращениювремени созревания, так как ацетолактат быстро декарбоксилируется до пригодного для ферментации ацетоина безкакого-либо образования диацетила,фермент можно добавлять перед иливо время основной ферментации, гдерН выше, нежели во время процессасозревания.Вместо использования фермента всвободном состоянии его можно использовать в иммобилизованном состоянии,причем иммобилизованный фермент добавляют к суслу во время или при продолжении ферментации. Иммобилизованный фермент можно также хранить вколонке, через которую пропускаютферментируемое сусло или пиво. Фермент можно иммобилизовать отдельноили использовать совместно иммобилизовачные дрожжевые клетки и ацетолактатдекарбоксилазу,Применение иммобилизованного фермента позволяет ускорять продолжительность получения пива, так какферментацию пива можно осуществлять,пропуская сусло через колонки, содержащие иммобилизованные дрожжи и иммобилизованные ферменты, необязательнов совместно иммобилизованном состоянии, Если процессы основной ферментации и созревания объединяют для1303033 6 стабильностью и активностью при рНвыше 5, целесообразно использоватьацетолактатдекарбоксилазу в химическимодифицированном состоянии для получения высокой стабильности и/или оптимальной активности в интервале рН4-5.П р и м е р 1. Порционная ферментация и быстрое созревание пива10 с использованием ацетолактатдекарбоксилазы.1 л стерильного сусла из суслакрепостью 10,7 Р инокулируют пивнымидрожжами Бассйагошусея саг 1 ягегцепя 1 яв количестве 20 х 10 клеток 1 л. Спус 6тя 6 дн при 10 С процесс основнойОферментации заканчивается, причемослабление пива определяется как2,0 Р. Содержание свободного и свя 20 занного диацетила (т.е. диацетила,полученного из с-ацетолактата) в пиве определяют как 0,12 и О,/1 ч./млн.Затем пиво декантируют от выпавшихв осадок дрожжей и смешивают со 100 мл25 Кгецяеп , т,е, интенсивно ферментиц црованного пива, полученного из сусла,инокулированного дрожжами за 48 ч доэтого. Более того, добавляют 25 мгацетолактатдекарбоксилазы, выделен 30 ной из АегоЬасгег аегояепея. После24 ч выстаивания при 1 ОС для вторичного ферментирования и созреванияопределяют содержание свободного исвязанного диацетила как 0,05 и0,10 ч./млн соответственно, Затемопиво охлаждают до -1 С и оставляютвыстаиваться в течение двух днейпри этой температуре, а затем готовоепиво фильтруют,40 П р и м е р 2. Непрерывная ферментация и быстрое созревание пива.250 г пивных дрожжей БассЬагошусеясаг 1 яЬегяепядя, выделенных центрифугированием, суспендируют в 350 мл 45 50 55 непрерывного превращения сусла в готовое пиво, производительность зависит от объема и диаметров колонн, Такой процесс уменьшает затраты труда и снижает себестоимость продукции,Предлагаемый способ можно использовать не только для приготовления пива, но и для изготовления вина, где достигаются аналогичные преимущества, в частности снижение времени вызревания и упрощение процесса. Ин" терес представляет использование ферментов, превращающих ацетолактат в связи с так называемой "Ма 1 о 1 асс 1 с ферментацией. Этот способ, который осуществляют с помощью таких микроорганизмов, как виды 1 ецсопояг.ос, 1.ассоЬас 11 ця или Рей 1 ососсця, осуществляют после основной ферментации вина для повышения рН продукта, также как и его биологической стабильности и для улучшения аромата вина. Однако такой способ может стать причиной потери аромата за счет диацетила, образование которого может быть понижено с помощью ацетолактпревращающего фермента. Способ можно использовать при промышленном производстве зтанола так, как продукты ферментации, которые получают и при этом не содержат или практически не содержат диацетила, что упрощает процесс дистипляции в случае азеотропной перегонки для получения абсолютированного этанола, т.е. чистого безводного этанола.Ацетолактаткарбоксилазу можно выделить, например, иэ АегоЪасег аегояепея. Однако можно также испольэовать и ацетолактат-превращаю-, щие ферменты, полученные из других источников, например, видов Вас 11 ця, ЕпгегоЬасгег, К 1 еЬяде 11 а, 1 ецсопоятос, Беггаг.1 а ц Бсгер 1 ососсця и некоторых видов Асг,1 пошусегея й грибков,Подходящие ацетолактактные редукто-изомеразы и изомеразы можно вьщелить иэ бактерий, таких видов, как Е. Со 11 или АегоЬассег аегояепея или иэ Мецгоярога сгаяяа, дрожжей Ба 1 шопе 11 а или растений. Так как рассматриваются ферменты в аминокислотном метаболиэме,следует ожидатьих наличия почти во всех живых клетках.Если процесс спиртовой ферментации происходит при рН в интервале 4-5, а многие легко доступные ацетолактатдекарбоксилазы, выделенные из микроорганизмов, обладают оптимальной З -ного стерильного раствора натрийальгината. Эту смесь по каплям добавляют к 10 л стерильного О, 1 М СаС 1 для желатинизации альгината кальция с образованием сферических, содержащих дрожжи частиц диаметром около 3 мм.Их оставляют выстаиваться в раст-. воре хлористого кальция в течение 12 ч при 4 С, а затем набивают в колонку диаметром 10 см и высотой 5 см. Через этот реактор прокачивают стеорильное сусло при 10 С со скоростью 0,15 л/ч причем крепость сусла составляет 10,7 Р. Ослабление злюата на7 (ЗОЯ выходе из реаттора 2, 1 Р, а по дагцым газовой хроматографии, содержание свободного и связанного диацетила 0,15 и 2,21 ч./млц соответственно. К 1 л пива из реактора добавляют 25 мг ацетолактатдекарбоксилазы. Пиво оставляют выстаиваться при 10 С в течение 24 ч, а затем прокачивают через другой реактор с иммобилизованными дрожжами, так что время пребы- О вания составляет 5 ч. Содержание свободного и связанного диацетила в элюате определяют как 0,05 и 0,10 ч./млн соответственно. Затем температуру понижают до -1 С и после выстаивания 15 в течение двух дней при этой температуре готовое пиво декантируют от осадка и окончательно фильтруют.П р и м е р 3. Порционная фермецтация и быстрое созревание пива с 20 применением ацетолактатной редуктоизомеразы.1 л стерильного сусла фермгнтируют Яассцагоаусез саг 1 зЬег 8 епз 1 з как описано в примере 1, После б дн ос новной ферментации содержание в пиве свободного и связанного диацетила по определению составляет 0,10 и 0,61 ч./млн соответственно. Пиво декантируют от остаточных дрожжей и 301добавляют 100 мл "Кгецзеп, как описано в примере 1, вместе со 100 мг д -ацетолактат-редукто-изомеразы, полученной из Е. со 11. Затем пиво оставляют выстаиваться в течение еще 24 ч при 10 С, после чего определяют содержание в нем свободного и связанного диацетила, которое составляет 0 03 и 0 09 ч./млн сбответственно.оЗатем пиво охлаждают до -1 С и ос тавляют выстаиваться на 2 дн при этой температуре, а затем готовое пиво фильтруют.(38Дрожжевой эксгракт 10Триптоза 10Культивирование ведут в бродильном чаце емкостью 20 л при 37"С и аэрации, клетки собирают ц средцеэкспоцецциальцой фазе путем цсцтрифугиронания и.затем промывают два раза Фосфатцым буфером прц рН б 8. Затем биомассу суспецдируют в 20 мМ Фосфатномбуфере прц рН 6,8 и гомогенизируют в гомогецизаторе МантоцГаулина при 600 атм, Разрушенные клетки затем удаляют центрифугированием и во всплывший при центрифугировании слой добавляют ионообмеццую смолу ДЕ, которую загружают в колонку и Фермент элюируют Фосфатом концентрацией от 20 мМ до О,б М при рН 6,8. Фракции исследуют на Ферментную активность, активные фракции обьедицяют и к цим добавляют сульфат аммония в количестве 0,6 г/мл. Перед использованием фермента в процессе необходимое количество этой суспензии в сульфате аммония центриФугируют и полученный осадок растворяют в 20 мМ фосфатном буфере при рН 6,8 и подвергают диалиэу ца фоне того же буфера.Иммобилизовацные дрожжевые клетки БассЬагошусез сегеч 1 з 1 ае вводят в виноградный сок, содержащий примерно 107 сбраживаемых карбогидратов. После 2 дн брожения свежеприготовленный раствор ацетолактатдекарбоксилазы добавляют в бродящую среду при концентрации 40 кЕ/л, после чего брожение продолжают еще 5 дн. Содержание ацетолактата вместе со свободным диацетилом в содержащем фермент растворе определяют и оно составляет 0,10 ч/млн.П р и м е р 4. Получение фермента, способствующего созреванию вина.Микроорганизмы АегоЬасгег аегояепез культивируют в 1 л среды, содержащей, г: 50 55 КН РО1(а НРО "12 Н О1(а ОБаС 1М 8804 7 ОСаС 1 6 Н ОРеВО 7 ОМпС 1 Н О2Глюкоза 1,5 9,0 1,5 1,5 О, 15 0,45 0,02 0,01 90 П р и м е р 5. Этот пример иллюстрирует иммобилизацию ацетолактатной декарбоксилазы в матрице геля альгината кальция. Влажные клетки штамма Вас 111 цз 1,1 сЬеп 1 Гогп 1 з, генерирующие ацетолактэтную декарбоксилазу ,50 г влажных клеток), суспендируют в 50 мл 0,9 Е-ного раствора хлористого натрия. В образовавшуюся суспензию добавляют 100 мл 47-ного раствора альгината натрия, после чего полученную смесь по каплям переносят в О, 1 М раствор хларида кальция. Таким образом, получают небольшие гранулы альгицата кальция, содержащие ацетолактатную декарбоксила3 10ацетолактата и свободного диацетипа с 1,9 до 0,10 ч.млн,Ф ор мула из об ре те ни я 2, Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что фермент исполь,зуют в иммобилизованном виде. Составитель А. Ульянова Редактор Н. Рогулич Техред,Д.Олейник Корректор М. СамборскаяЗаказ 1228/58 Тираж 500 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Производственно-полиграфическое предприятие г, Уяц ород, ул. Проектная,9 130303зу. Эти гранулы промывают 3 раза порциями по 500 мл фосфатного буфера прирН 7 и затем используют аналогично.примеру 1.П р и м е р 6. Влажные, свежеприготовленные клетки Вас 111 цз ЬхсЬепЕогпаз (50 г), производящие ацетолактатдекарбоксилаэу, суспендируютв 250 мл 0,1 М фосфатного буферарН 6,0, Эту суспензию тщательно пере Омешивают н охлаждении до 5 С и приэтой температуре в течение 30 мин покаплям добавляют 50 мл фосфатногобуфера, содержащего 2,57 глутаровогоальдегида. Реакционную смесь затем 15выдерживают в течение 3 ч при 5 С,после чего клетки, содержащие ацетолактатдекарбоксилаэу, удаляют изреакционной смеси путем центрифугирования. В последующем эти клеткипромывают 5 раэ порциями по 250 млфосфатного буфера, Полученный химически модифицированный фермент используют согласно предлагаемому способу, при этом химически модифицированный фермент проявляет превосходнуюстабильность по сравнению с немодифицированным ферментом, причем рНнаходится в интервале 4-6,Предлагаемый способ позволяет сог Олано примеру 4 снизить содержание 1 Способ получения ферментированных спиртовых напитков, предусматривающий ферментацию сусла дрожжами, созревание его и введение в процессе ферментации или после него, или в процессе созревания фермента, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью снижения содержания диацетила, в качестве фермента используют ацетолактатдекарбоксилазу или иэомеразу, или редуктоизомеразу. 3 Спосо по п 1 о т л и ч а ю щ и й с я тем, что дрожжи используют в иммобилиэованном виде. 4, Способ по и. 1, о т л и ч аю щ и й с я тем, что ацетолактатдекарбоксилазу используют в химически модифицированном виде для обеспечения стабильности и/или активности ее при значении рН среды 4-5.