Способ определения фоксима в секционном материале

(59 4 С 01 Н 33/48НЫЙ КОМИТЕТ СССР ОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬПЪЙ фг;: .,гь 1",Д Ание изОБРе ения 1 .цКОМ ТЕЛЬСТВУКрасноговательски ициныА.М. О рловаизу фосхроматоК аналцидоводуктапросы х питанияпитания,рование и обна- удебно-химиического ма 983, У 2,(21) 3788234/28" 14 (22) 19.07.84 (46) 07.12.85. Бюл. (71) Ордена Трудовог Знамени научно-иссле институт судебной ме (72); Н.А. Горбачева и (53) 616,07 (088.8) (56) Письменная М.В, форорганических пест знзимным методом в и и биосубстратах. - В 1981, В 1, с. 69-71.Горбачева Н.А. Изол ружение байтекса при с ческом анализе биоло териала - Фармация, с. 32-42.афи- ас(54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОКСИИАВ СЕКЦИОННОМ МАТЕРИАЛЕ путем извлечения его из пробы н-гексаном в присутствии безводного сульфита натрия,экстракционного перераспределенияв системе н-гексан - диметилформамидс последующим хроматографическиманализом в тонком слое кремниевойкислоты, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью повышения чувствительности способа, хроматогрческий анализ осуществляют на плтинах "Силуфол", импрегированных607-ным раствором диметилформамидав метаноле и н-гексане, насыщенномдиметилформамидом.50 55Изобретение относится к химическому анализу секционного материала для обнаружения в нем Фосфорорганического инсектицида Фоксима 0,0 диэтилтиофосфорил-О-(альфа-цианобенз- альдоксим) при судебно-медицинской экспертизе острых отравлений.Цель изобретения - повышение 1чувствительности способа.Способ осуществляется следующим образом.для изолирования фоксима к 25 г среднейпробы измельченного органа (печень, почки, желудок кишечник ) в колбе вместимостью 200-250 мл с притертой пробкой добавляют 50 мл н-гексана, 25 г безводного сульфата натрия и оставляют на 12 ч при периодическом перемешивании. Жидкость отфильтровывают в колбу отгонки расрастворителя. Остаток в колбе вновь заливают 50 мл н-гексанаи извлекают цпри периодическом взбалтывании в те. чение 2 ч. Извлечение отфильтровывают и присоединяют к основному, Операцию повторяют. Растворитель отгоняют на ротационном вакуумномиспарителе при 25-30 С до объема 10-. 12 мл. С целью отделения основной массы балластных веществ пРоизводят экстрак; ционную и хроматографичеакую очисткуй делительную воронку Р 1 вместимостью 75-100 мл с помощью н-гексана переносят сконцентрированное до 10-20 мл извлечение из биологическо-. го материала так, чтобы объем гексановой Фазы составил 25 мл, В делительную воронку наливают 25 мл диметилформамида (ДИФА ), насыщенного н-гексаном, и экстрагируют при энергичном вэбалтывании 3 мин. Нижнюю фазу ДИФА переносят в делительную воронку Ф 2 вместимостью 75-100 мл, содержащую 25 мл н-гексана, насыщенного ДИФА. В делительную воронку 91 добавляют 25 мл ДИФА, насыщенного н-гексаном. Содержимое делительных воронок В 1 и, 2 взбалтывают 3 мин. После разделения слоев из делительной воронки Р 2 ДИФА переносятв делительную воронку 93 вместимостью 500 мл, содержащую 40 мл 122-ного раствора хлорида натрия, а из делительной воронки 1 Н " в делительную воронку У 2. В делитель ную воронку У 1 добавляют 25 мл ДИФА 19 б 772 2 насыщенного н-гексаном. Содержимоеворонок У 1 .и 2 взбалтывают 3 мин,Слой ДИФА из воронки Р 2 переносятв воронку УЗ, а из воронки Р 1 - вворонку 92. Гексановую Фазу в воронке 91, содержащую экстрактивные вещества, отбрасывают. Взбалтываютсодержимое делительной воронки У 33 мин, по разделении слоев ДИФА из 19 влечение отделяют н присоединяют кэкстракуту в воронке УЗ. ГексановуюФазу в воронке У 2, содержащую экстрактивные вещества, отбрасывают. Содержимое воронки УЗ осторожно перемешивают,15 при этом отделяется слой н-гексана.Добавляют 10 мл н-гексана и реэкстрактируют фоксим взбалтыванием в течение3 минеПосле разделения слоев нижнюю20 водную фазу отделяют в колбу вмести,мостью 50 мл, гексановую фазу переносят в делительную воронку 1 Р 4 вместимостью 75-100 мл, содержащую 50 мл123-ного раствора хлорида натрия,25 Раствор из колбы переносят в делительную воронку УЗ, стенки промывают10-15 мл 123-ного раствора хлориданатрия и присоединяют к Раствору вделительиой воронке 93. Водную фазу30 экстрагируют еще двумя порциямин-гексана по 1 О мл. Гексановыеизвлечения. переносят в делительнуюворонку 94, взбалтывают с растворомхлорида натрия. Верхнюю гексановуюФазу отделяют и переносят в колбувместимостью 50 мл с -1 О г безводно.го сульфата натрия,Делительную ворон: ку.94 промывают 5-8 мл и н-гексана,присоединяют раствор к основному40 извлечению. Через ЗО мин гексано=. вое извлечение декантируют в мернуюколбу вместимостью 50 мл, доводятн-гексаном до метки, перемешивают.Хроматографическую очистку45 производят следующим образом,25 мл полученного гексановогораствора, соответствующие 12,5 гисследуемого органа, выпариваютпри комнатной температуре до объема0,5-1 мл. С помощью стеклянногокапилляра, используя для смывабензол, раствор переносят в видеполосы длиной 6,5-7 см на стартовуюлинию хроматографической пластинкис закрепленным слоем кремневой кис"лоты, Стеклянные пластины 1318 смизготавливают способом поливки попрописи иэ расчета на 1 см: кремне 23вой водой кислоты (150 меш ) 0,026 г, гипса (150 меш ) 0,0013 г, дистиллированной воды 0,06 мл. Пластинки сушат при комнатной температуре 12 ч. При перегрузке сорбента, что иногда наблюдается при исследовании объектов с большим содержанием жира, для препаративной хроматографической очистки используют меньшую аликвоту исследуемого раствора, например соот. ветствующую 6-8 г органов.На стартовую линию той же пластинки на расстоянии не менее 2 см от края пластинки и 2,5-3 см от края . полосы исследуемого извлечения наносят в виде пятна диаметром 1-2 мм раствор Фоксима в бензоле (метчик )в количестве 10-2 мкг в пятно. Через 10 мин хроматографируют в систе ме бенэол, фронт растворителя 14-14,5 см, время хроматографирования 30-40 мин. При этом фоксим (Кй 0,47-060) отделяется от экстрактивных веществ (КЕ 0,70-0,95). Орга-. нический растворитель удаляют при комнатной температуре 15-20 мин.Часть хроматограммы, соответствующую полосе исследуемого раствора, защищают стеклянной пластинкой, а открытую часть с метчиком опрыскивают палладиевым реактивом. Через 15-20 мин обнаруживается пятно мет-, чика.. Из защищенной части пластинки, соответствующей расположению метчика, делают соскоб сорбента в виде прямоугольной полосы шириной 4 см ( по 2 см в обе стороны от центра проявленного метчика ), Соскоб переносят в стеклянную хроматографическую колонку (внутренний диаметр 1,5 см ), на дно которой предварительно помещают небольшой тампон ваты, и элкаруют 50 мл смеси н-гексана - ацетон 1:1, добавляя порциями по 5-8 мл и обмывая стенки колонки. Элюат коли. чественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл с помощью н-,гексана и объем раствора доводят до метки тем же растворителем. Аликво тыраствора исследуют. Хроматографическое исследованиепроводят последовательно в двухсистемах .1. на пластинках силикагеля КСКв системе бензол при проявлениихромогенными реактивами на различньщфункциональные группы фоксима ( реак 96772 4циями, описанными ниже в пунктаха или б, в и г )при сравнении КГисследуемого вещества с КЕ Фоксимаметчика (внешний стандарт ); исследо ванне в системе бенэол может бытьпроведено и на пластинках "Силуфол"в сочетании с хромогенными пробами.,описанными в пунктах а (или б )и в;П. на пластинках "Силуфол", им 10 прегнированных 607-ным растворомДМФА в метаноле в системе н-гексан,насыщенным ДИФА. Обнаружение фоксина осуществляют палладиевым реактивом (пункт в ). Разделение. проводят 15 при использовании внутреннего метчика-фоксима.При исследовании реакциями спалладиевым, бромфеноловым синим,4-НБП реактивами и пробой на органи-, 20 чески связанный фосфор, возможнопроявление пятен экстрактивных веществ, но они отличаются от Фоксимапо величине Ы.Хроматографическое исследование 25 проводят следующим образом;1. Аликвоты элюата, эквивалент.ные 2 г органов ( для обнаруженияпалладиевым и 4-НБП реактивами ) и2,5 г органов (для реакции обнаружеЗ 0 ния по Фосфору и с бромфеноловымсиним реактивом ), наносят послепредварительного удаления избыткарастворителя на стартовую линию хроматографических пластинок с тонкимслоем силикагеля КСК (стеклянныепластинкиЗх 8 см изготавливают спо-собом поливки по прописи иэ расчетана 1 см; силикагеля КСК (150 меш )0,013 г, гипса (150 меш ) 0,0007 г, 40 дистиллированной воды 0,03 мле пластинки активируют при 110 С в течение 1 ч в виде пятен диаметром0,3"0,5 см, Для перенесений остатков,используют бензол, Растворы наносят 45 на пластинку с помощью стеклянныхкапилляров. На расстоянии не менее2 см исследуемых пятен наносят пятно метчика ( раствор фоксима в бензоле 3-5 мкг в пятно ). Хроматограммуразвивают в системе бензол. Фронтрастворителя 14 14,5 см. Растворитель удаляют при комнатной температуре в течениене менее 30 мин ипроводят реакции обнаружения ЫФоксима 0,45-0,60. а. Обнаружение палладиевым раствором: хроматограмму опрыскивают реактивом (водный раствор 5 Ж-ного5 1196772.хлорида палладия, содержащий 5 млконцентрированной соляной кислотыв 100 мл раствора, перед употреб.- лением реактив разбавляют этанолом1:12 ). Пятна желто-коричневого, коричневого или бурого цвета (в зависимости от количества фоксима )проявляются через 15-20 мин, приотносительно больших количествахвещества, а при близких к границе - 10в течение 24 ч,б. Обнаружение бромфениловымсиним реактивом: хроматограммуопрыскивают бромфениловым,синимреактивом 1 смесь 2%-ного растворанитрата серебра в воде и 0,4%-ногораствора бромфенилового синего воацетоне 1:1,. нагревают при 50 С1 О мин ). По охлаждении опрыскивают 5%-ным раствором уксусной кислоты. Появляются пятна синего цветана желтом фоне,в. Обнаружение 4-НБП 14- п-нитробенэил )пиридин 1: пластинку опрыски вают до увлажнения 2%-ным ацетоновым раствором 4-НБП, затем, избегаясильного увлажнения, 20%-ным раствором карбоната аммония, разбавленнымацетоном 1:1, нагревают в сушильномшкафу при 120 С 10 мин, охлаждают,опрыскивают 10%-ным растворомгидроксида натрия в 50%-ном этаноле,На белом фоне появляются фиолетовосиние пятна, постепенно обесцвечивающиеся, Сразу же отмечают проявленные зоны.г. Обнаружение по фосфору: хроматограмму (в камере для опрыскиванияпод тягой ) опрыскивают, избегая полного увлажнения, раствором хлорной 40и соляной кислот в присутствии молибдената аммония реактив У 1 для обнаружения по фосфору: к 1%-ному раствору молибдата аммония в 0,1 М растворе соляной кислоты добавляют 5% 45хлорной .кислоты 57% и нагреваютпри 230-250 С в течение 60 мин (подтягой ) в сушильном шкафу. По охлаж-,дении пластинку опрыскивают реактивом В 2 5 г молибдата натрия(БаМоО НО) растворяют в 150 мл2 н. соляной кислоты и смешивают с1 г малахитового зеленого в 100 мл2 н. соляной кислоты; через 1-2 чфильтруют через бумажный фильтр,55хранят в темной склянке). 50 Через 5-10 мин отмечают пятназеленого цвета на оранжевом фоне,В описанной хроматографнческой системе аналогично фоксиму проявляет ся и имеет такое же значение величины КГ байтекс, близкие значенияКК - дифос, трихлорметафос-З,трихлорметафос. Для исключения их проводятдополнительную реакцию обнаруженияс 4- аминоантипирином, На хроматографическую пластинку наносят аликвоту элюата, эквивалентную 2 г органа, а также пятно метчиков - байтекса и других фосфорорганических пестицидов (ФОП ) (3-5 мкг в пятно ) ихроматографируют в той же системе. Пластинку опрыскивают 6%-ным раствором гидроксида натрия, нагревают при 120 С в сушильном шкафу 30 мин. По охлаждении опрыскивают 1%-нымраствором 4-аминоантипирнна гидрохлорида, затем 1,4%-ным раствором феррицианида калия. В присутствиибайтекса, дифоса, трихлорметафоса -3и трихлорметафоса образуются пятнарозового цвета. При использовании пластинок "Силуфол" на стартовую линию наносят аликвоты элюата, эквивалентные 0,5 г органа, метчик - раствор фоксн ма в бензоле (1-2 мкг в пятно ). Фронт растворителя 10 см. Обнаружение фоксима проводят палладиевым (или бромфеноловым синим ) и 4-НБП реактивами, обнаружение байтекса, дифоса, трихлорметафосаи трихлорметафоса - реакцией с 4-аминоанти- . пирином. Кй-фоксима 0,40-0,63. П. Для подтверждения обнаруженияфоксима и для дифференциации фоксимаот байтекса, а также от других ФОП(при их обнаружении )проводят исследование на пластинках "Силуфол",импрегнированных 60%-ным растворомДИФА в метаноле, используя в качестве подвижной фазы н-гексан, насыщенный ДИФА. В связи с тем, что в даннойхроматографической системе при исследовании может наблюдаться разбросв значениях М особенно в присутствии следов экстрактивных веществ,используют внутренний стандарт (метчик- фоксим. Оценку результатованализ по величинам РЕ производятна основании сравнения Ы-исследуемой пробы, в которую введен внутренний метчик - фоксим, и исследуемойпробы, к которой внутренний метчикне был добавлен,7 1196На пластинки "Силуфол" на расстоянии не менее 2,5 см от края и 2,5 см одна от другой наносят в виде пятендиаметром не более 0,5 см аликвоты исследуемых извлечений, эквивалентные 0,5 г органа. Приведенные аликвоты элюата являются оптимальными для граничных и приграничных концентраций фоксима - 230-400 мкг в 25 г органа, при больших концентрациях 1 О наносят меньшие аликвоты раствора. При этом из элюата каждого органа исследуют две аликвоты, к одной из иих добавляют внутренний стандарт фоксим 1 в количестве 5-10 мкг в ис". 15 следуемую аликвоту), к другой не добавляют. Фоксим-метчик добавляют в виде раствора в н-гексане или ацетоне непосредственно к отобранной аликвоте элюата, перемешивают, 20 органический растворитель удаляют до 0,2-0,5 мл и остаток наносят в виде пятна на пластинку ("Силуфол" 20 х 20 ). При обнаружении байтекса или других ФОП их также вводят в анализируемую пробу в качестве внутренних метчиков (5-10 мкг препарата в пятно ). Расстояние наносимых пятен от края хроматографической пластинки должно быть не менее 3 см, 30 расстояние между пятнами - не менее2 си.После нанесения на пластинку исследуемых проб и по удалении растворителя (5-10 мин) пластинку погружают в 60%-ный раствор ДИФА в мета" ноле так, чтобы ее поверхность была смочена до уровня на 0,5 см выше нанесенных на стартовую линию исследуемых растворовВлажную часть 40 пластинки осушивают, прикладывая лист фильтровальной бумаги. Область . пластинки с пятнами и ниже стартовой линии опрыскивают из пульвери- . затора до легкого увлажнения раствЬ. 45 ром ДИФА в метаноле. Пластинку оставляют на 10-12 мин под тягой, затем помещают в хроматографическую камеру, содержащую н-гексан, насыщенный ДМФА. Предварительное насы щение камеры парами растворителя осуществляют в течение 1-1,5 ч. Перед внесением каждой новой хро 772 8матографической пластинки камеру насыщают парами растворителя не менее 40 мин, Фронт растворителя 12-14 см. Органический раствори- тель удаляют под тягой в течение 1, 5-2 ч, После этого пластинку исссдуют реакциями, описанными в пунктах а и в, КГ фоксима 0,58-0,73. Определяют и сравнивают величины М проявленных зон пятен исследуемых извлечений (без внесенных метчиков-стандартов и с внесенными внутренними метчиками ), При одновременном присутствии фокси ма и других исследованных ФОП наблю дается четкое отделение их от фоксина. Экстрактивные вещества Г Оф 0,90-1,0) также отделяются от фоксима.П р и м е р. Исследуют три пробы почек из трупа лица, погибшего от травматического повреждения. К полученным элюатам после хроматографической очистки, эквивалентеым 12,5 г навески, обозначенным У 1 и У 2, добавляют в виде раствора в ацетоне 100 мкг фоксима, в пробу У 2 кроме того 200 мкг байтекса; проба УЗ- контрольная (фоксим и байтекс не добавляли ).На пластинку "Силуфол" наносят в виде пятен на стартовую линию аликвоты полученных растворов (У 1-3), эквивалентные 0,5 г органа. Параллельно к другим таким же аликвотам элюата проб У 1-3 добавляют внутренний метчик - фоксим (5 мкг в пятно ). Исследуют на пластинках "Силуфол" импрегнированных 60%-ным раствором ДИФА в метаноле, в системе н-гексан, насыщенный ДИФА. Зоны разделенных веществ опытов представлены в табли- це Из таблицы следует, что в пробеУ 1 обнаружен только фоксим (Ы0,72-0,74), а в пробе У 2 фоксим(КГ 0,71-0,73 и байтекс (КЕ 0,470,50 ). Зоны с ВХ 0 обусловлены .экстрактивными веществами, дВХфоксима и байтекса составляет0,23-0,24, что свидетельствует об .удовлетворительном разделении этихсоединений в присутствии экстрактивных веществ тканей почек.,7 0 3 Составитель М, Познякедактор А. Шишкина ТехредЛ,Мартящова Корректор утяг каз г. Ужгород, ул. Проектная, 4"Пате Фили 59/43 Тираж 896 ВНИИПИ Государственного по делам изобретений 113035, Москва, Ж, Р