Способ получения модифицированного кремнеземного сорбента

1 ТЕНИ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕк авторскому свидетельству ови ина то- окоиф ОЮЗ СОВЕТСКИХОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИКОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕЕДОМ СТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР(71) Отделение Института химической физики СССР; Институт биоорганической химии им,М.М.Шемякина(56) Авторское свидетельство СССР М 750370 В 010 15/08, 1979.Брук МА Абкин АДДемидович В.В, Ерощ Л.ВУрман Я.Г, Слоним И.Я, Леденева Н.В. Иссл дование радиационной полимеризации тетраф рэтилена адсорбированного на некоторых выс пористых сорбентах - Высокомол.соедсер. А 1975, т.1 7, й 1, с 3-12.(Я) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННОГО КРЕМНЕЗЕМНОГО СОРБЕНТА (57) Изобретение относится к химически мод цированным кремнеземным "орбентам для хроматографии и позволяет повывить адсорбционную емкость и снизить необратимую сорбцию биополи - меров, Кремнезем вакуумируют в ампуле при 573 К и 10 Торр и напускают озон из расчета 1 г на 10 г кремнезема. Выдерживают при комнатной температуре 5 ч и удаляют летучие продукты при 200 - 400 К под вакуумом. Добавляют перфтормономер (тетрафторэтилен, гексафторпропилен или его димер) из расчета 001-005 г/м поверхности носи 2теля. Выдерживают до прекращения падения давления в системе и удаляют избыток мономера Ампулу вакууиируют до 10 Торр и нагревают до 605 - 620 К со скоростью 0,5 - , 1,0 град/мин. Выдерживают при 605 - 620 К 15 - 20 мин и охлаждают до комнатной температуры со скоростью 0,1 - 0,2 град/мин. 1 табл.Изобретение относится к химически модифицированным кремнеземным сорбентам для хроматографии и может быть использовано для разделения, концентрирования и очистки биополимеров. 5Целью изобретения является повышение адсорбционной емкости и снижение необратимой сорбции по отношению к биополимерам.Сущность изобретения заключается в 10 следующем.Кремнезем в выбранном количестве с известной удельной поверхностью и диаметром пор помещают в стеклянную ампулу, присоединяют к вакуумной установке. 15 Ампулу нагревают в песчаной бане до температуры 573 Кпри одновременном вакуумировании до остаточного давления 10 Торр и заполняют озоном из расчета 1 г на 10 г кремнезема. Систему выдерживают 5 ч 20 при комнатной температуре, и непрореаги-. ровавший озон и летучие продукты реакции озона с кремнеземом удаляют вакуумированием при 200-400 К. После этого в систему добавля ют перфтормономер (0,01 - 0,5 25 на 1 м поверхности кремнезема), выдерживают до прекращения падения давления в системе и удаляют избыточное количество мономера любыл известным способом, Ампулу откачивают до остаточного давления 30 10 Торр и нагревают до температуры 605 - 620 К со скоростью 0,5 - 1,0 град/мин. Систему выдерживают 15 - 20 мин при этой температуре и охлаждают со скоростью 0,1- 0,2 град/мин до комнатной температуры, 35При реализации указанного способа получения сорбента образуется сплошное равномерное покрытие, макромолекулы которого прочно удерживают на поверхности кремнезема за счет химических связей, Из быточное количество озона удаляют в интервале температур от 200 до 400 К, Выбор диапазона температур удаления озона обусловлен тем, что при низкой температуре ( 200 К) озон, по-видимому, прочно сор бируется кремнеземом и плохо удаляется, что приводит при напускании тетрафторэтилена к взрыву, При высокой температуре ( 400 К) ускоряется гибель радикалов, образующихся за счетпроцессов взаимодейст вия озона и кремнезема, в результате чего не образуется сплошного полимерного покрытия, что приводит к увеличению необратимой адсорбции разделяемых веществ. В качестве перфтормономера можно исполь зовать, например, тетрафторэтилен, гексафторпропилен, димер гексафторпропилена и другие. Количество перфтормономера менее 0,01. г/м недостаточно для снижения необратимой сорбции разделяемых веществ, Количество перфтормономера выше 0,05 г/м приводит к снижению адсорбцигонной емкости. При нагревании носителя, обработанного перфтормономером, выше температуры 620 К снижается механическая прочность полимерного покрытия, при нагревании ниже температуры 605 К время термообработки увеличивается. Время тер-. мообработки 15 - 20 мин выбрано исходя из известных скоростей релаксационных процессов в полимерном, покрытии. Нагрев со скоростью менее 0,5 и более 1,0 град/мин, также как и охлаждение скоростью менее 0,1 и более 0,2 град/мин, приводит к неравномерности полимерного покрытия.В соответствии с предлагаемым решением пористыми кремнеземными носителями могут являться макропористые стекла, силикагели, диатомиты с размером пор более 6 нм, Выбранные интервалы структурных характеристик пористого кремнеземного носителя являются оптимальными, так как в случае малых диаметров пор очень трудно получить равномерное полимерное покрытие.П р и м е р 1, Получение сорбента, имеющего толщину полимерного покрытия 10 нм, 10 г макропористого стекла МПС ГХ (диаметр пор 200 нм, уд,поверхность 30 м /г), помещают в стеклянную ампулу, присоединяют к вакуумной установке. Ампулу нагревают в песчаной бане до температуры 573 К при одновременном вакуумировании до остаточного давления 10 з Торр, после чего заполняют. озоном (1 г). Систему выдерживают 5 ч при комнатной температуре, и непрореагировавший озон и летучие продукты реакции озона с кремнеземом удаляют вакуумированием при той же температуре. После этого в систему добавляют 4,6 г тетрафторэтилена, выдерживают до прекращения падения давления в системе и удаляют вакуумированием избыточное количество мономера, Ампулу откачивают до остаточного давления 10 Торр и нагревают до температуры 620 К со скоростью 1,0 град/мин, Систему выдерживают 20 мин при той температуре и охлаждают до комнатной температуры со скоростью 0,1 град/мин. В результате такой обработки ва поверхности кремнезема образуется перфторполимерная пленка толщиной около 10 мин (данные ртутной порометрии), состав которой определен методами элементарного микроанализа (мас,: С 34,2; Е 64,9 О 0,09). Методом ИК-спектроскопии в плевке найдены полосы поглощения, соответствующие колебаниям связей С - Е (1410 см ),П р и м е р 2. Получение сорбента, имеющего толщину полимерного покрытия2 нм, Синтез ведут как в примере 1. но вместо МПСГХ используют МПС ГХ (диаметр пор 25 нм, уд.поверхность 105 м /г), избыток озона и летучих продуктов2реакции удаляют вакуумированием при температуре 200 К, а после удаления озона и летучих продуктов реакции в систему добавляют 10,8 г тетрафторэтилена. В результате такой обработки на поверхности кремнезема образуется перфторполимерная пленка толщиной около 2 нм (данные ртутной порометрии), состав которой определен методами элементарного микроанализа (мас,: С - 34,3; Р - 64.6; О - 1,3) ИК-.спектр сорбента такой же, как в примере 1.П р и м е р 3. Получение сорбента, имеющего толщину полимерного покрытия 5 нм. Синтез ведут, как в примере 1, но вместо МПСГХ берут МПСГХдиаметр пор 70 нм, уд.поверхность 70 м /г), избыток озона и летучих продуктов реакции удаляют вакуумированием при температуре 400 К, а после удаления озона и летучих продуктов реакции в систему добавляют 9,8 г тетрафторэтилена В результате такой обработки на поверхности кремнезема образуется перфторполимерная пленка толщиной около 5 нм (данные ртутной порометрии), состав которой определен методами элементарного микроанализа (мас,%; С -34,8; Г - 64,3; О -0,9). ИК-спектр сорбента такой же, как в примере 1, На сорбентах, полученных по примерам 1-3, и сорбенте по прототипу определена необратимая сорбция нуклеиновых кислот, являющаяся важным показателем качества сорбента и равномерности полимерного покрытия.Для определения необратимой сорбции транспортной РНК (тРНК) к 1 г сорбента, полученного по примерам 1-3, прибавляют 5 мл пропилового спирта, дегазируют под вакуумом. Затем спирт декантируют, сорбент промывают 0,01 М трис-НС буфером (рН = 7,5) и помещают в колонку размером 1 х 6 см. На колонку наносят 1 мг тРНК Е.со в 0,5 мл укаэанного буферного раствора и элюируют со скоростью 0,5 мл/мин общим объемом 10 мл. Послеэтого производят смену буфера (10 оуь пропанола в 0,01 М трис- НС, рН = 7,5), Собирают 10 мл элюата и спектрофотометрически определяют концентрацию тРНК, Умножая концентрацию на объем элюата (1 0 мл), получают содержание тРНК и содержанием ее в элюате представляет собой величину необратимой сорбции тРНК на сорбенте синтезированном по предлагаемому способу. Полученные результаты представлены в таблице. Для определения емкости сорбентов по тРНК От с сорбенте, попуно нного по примерам 1-3, помещают в колонку размерами 1х 6 см. На колонку наносят 20 мг тРНК Е.сов 10 мл трис-Нс буфера (рН "7,5). Контрольза выходом тРНК ведут с помощью проточ 5 ного спектрофотометра с длиной детектируемой волнь 1 254 нм, После начала выходапика его собирают в 25 мл элюата и по методике, описанной выше определяют количество сорбированной тРНК. Результаты10 представлены в таблице (в пересчете на 1 гсорбента).Сорбенты, полученные по примерам 13, были использованы для обессоливания,концентрирования и депротеинизации15 тРНК,П р и м е р 4 Синтез как в примере 1,но вместо МПСГХ берут силикагельмарки МСА(диаметр пор 560, нм, уд.поверхность 66 м /г), а после удаления озона20 и летучих продуктов реакции в систему добавляют 6,7 г тетрафторэтилена и выдерживают до прекращения падения давления всистеме. Затем удаляют избыточное количество мономера путем вакуумирования, отка 25 чивают до давления 10 Торр и нагревают.здо температуры 605 К со скоростью 0,5град/мин. Систему выдерживают 15 минпри этой температуре и охлаждают со скоростью 0,2 град/мин до комнатной темпера 30 туры. В результате. такой обработки наповерхности кремнезема образуется перфторполимерная пленка толщиной около 5 нм(данные ртутной порометрии), состав которой определен методами элементарного35 микроанализа (мас.о(у: С - 34,6; Р - 64.5; О 0,9). ИК-спектр сорбента такой же, как и впримере 1П р и м е р 5, Синтез ведут как в примере4, но вместо силикагеля МСАберут си 40 ликагель МСА1 уиаметр пор 1450 нм,уд.поверхность 30 м /н), а после удаленияозона и летучих продуктов реакции в систему добавляют 6,0тетрафторэтилена. В результате такой обработки на поверхности45 кремнезема образуется перфторполимерная пленка толщиной 8 нм, состав которойопределен методами элементарного микроанализа (мас,;(р: С - 34-2; Е - 64,9; О - 0,9),ИК-спектр сорбента такой же, как в примере50 1.Сорбенты, полученные по примерам 4-5, использовали для отделения плазмид отРНК и белков,П р и м е р 6. Синтез ведут как в примере55 1, но вместо МПСГХ берут силикагельАрмсфер Сил 6 (диаметр пор б нм, уд, поверхность 220 м 2/г), а после удаления озона илетучих продуктов реакции в систему добавляют 24 г гексафторпропилена, В результате такой обработки на поверхности10 20 25 30 40 кремнезема образуется перфторполимерная пленка толщиной около 2 нм (данные ртутной порометрии), состав которой определен методами элементного микроанализа (мас,%: С - 34,6; Е - 63,9; О - 1,5), ИК-спектр сорбента такой же, как в примере 1,, П р и м е р 7. Синтез ведут как в примере 1, но вместо МПСГХ берут силикагель Армсфер Сил 30 (диаметр пор 28 нм, уд.поверхность 80 м/г), а после удаления озона и летучих продуктов реакции в систему добавляют 8,6 г димера гексафторпропилена (цГфП). В результате такой обработки на поверхности кремнезема образуется перфторполимерная пленка толщиной около 2 нм (данные ртутной порометрии), состав которой определен методами элементного микроанализа (мас,%: С - 34,6; Р - 64,6; О,0). ИК-спектр сорбента такой же, как в примере 1.Сорбенты, полученные по примерам 6- 7, используют для обращенно-фазовой хроматографии пептидов, олигонуклеотидов, белков, витаминов и других биологически активных веществ.П р и м е р 8. Синтез ведут как в примере 1, но вместо ПСГХ берут диатомит(диаметр пор 800 нм, уд.поверхность 2 м/г), а после удаления озона и летучих продуктов реакции в систему добавляют 1,1 г тетрафторэтилена, В результате такой обработки на поверхности кремнезема образуется перфторполимерная пленка толщиной около 10 нм (данные ртутной порометрии), состав которой определен методами элементного микроанализа (мас.%: Р - 64,0; С - 64,8; О - 0,8). ИК-спектр сорбента такой же, как в примере 1. Сорбент, полученный по примеру 8, можно использовать как носитель для газовой хроматографии.П р и м е р 9, Проводят концентрирование, обессоливание и депратеинизацию тРНК, используя 2 г сорбента, приготовленного в соответствии с примерами 1-3 по следующей схеме: сначала приводят колонку в состояние равновесия с 0,01 м трис-НС буфером (рН = 7,5) по методике, описанной в примере 3, Затем прокачивают 100 мг солевого раствора тРНК, Загрязненной примесями белков, При этом тРНК количественно сорбируется на колонке, а солИ вымываются исходным буфером. После полного обессоливания (контроль ведут по злектропроводности элаата) адсорбированная тРНК вымывается 10%-ным раствором пропанола в исходном буфере в объеме 5 мл, Таким образом, одновременно происходит депротеинизация тРНК и ее концентрирование в.20 раз за 4,0 мин. Колонку можно регенерировать градиентом концентрации (от 0 до 50%) ацетонитрила общим объемом элюента 100 мл со скоростью 200 мл/ч, после чего ее можно использовать повторно.Пример использования сорбентов, полученных по примерам 4 - 5, для выделения плазмид.П р и м е р 10; Проводят очистку плазмид от РНК и белков. На колонку, содержа-. щую 2 г сорбента, полученного по примерам 4 - 5 и уравновешенную 0,01 м трис-НС буфером (рН = 7,5) по методике, описанной в примере 3, наносят 5 мл осветленного лизата плазмиды рВВ (60 мг). Плазмида элюатируется исходным буфером со скоростью 100 мл/ч. Собирают фракцию объемом 25 мл с момента начала выхода пика, При этом РНК и белки остаются на колонке, Ее можно регенировать по методике, описанной в примере 9. Продолжительность всего цикла составляет около 1 ч, после чего можно сразу начать новый.Примеры использования сорбентов, полученных по примерам 6 - 7.П р и м е р 11.Проводят разделение пептидов на колонке (2 х 65 мм), заполненной сорбентом, полученным по примерам 4 - 5, Элюацию ведут градиентом концентраций (0-50%) ацетонитрила в 1%-ной трифторуксусной кислоте общим объемом элюента 2400 мкл, Порядок выхода пептидов: А-цепь инсулина, Брадикинин, В-цепь инсулина, лизоцим, наивный инсулин (свиной).П р и м е р 12. Проводят разделение жирорастворимых витаминов на колонке (2 х.65 мм), заполненной сорбентом, полученным по примерам 6-7. Элюацию ведут ступенчатым градиентом концентраций10 1839325 Величина необратимой сорбции тРНК на сорбентах по примерам 1-3 и емкость сорбентов по тРНКретения ула ЧЕНИЯ МНЕЗЕ ий акт ного мономе с цель кости и и поивациюющим удкции оз ь Т.Ч или кинМорге нтал Состав Техред орректор М.Керецма ка актор Заказ 10 Тираж НПО "Поиск" Роспатент113035, Москва, Ж, Раушская одписно 5 ат "Патент", г. Уж, ул.Гагарина, 101 рои енно-издательскии СПОСОБ ПОЛУРОВАННОГО КРЕБЕНТА, включающстого кремнеземобработку перфторщийся тем, что,адсорбционной емобратимой сорбцибиополимерам, актозоном с последучих продуктов реа МОДИФИЦИМНОГО СОР- ивацию пори- носителя и ром, олтличзюю повышения снижения не- отношению к осуществляют 5 алением летуона с кремнеземом и избытка озона при температуре 200 - 400 К, обработку перфтормономером ведут из расчета 0,01 - 0,05 г на 1 м поверхности кремнезема с последующим удалением непрореагировавшего мономера, и обработанный кремнезем нагревают со скоростью 0,5 - 1,0 град/мин до температуры 605 - 620 К, выдерживают 15 - 20 мин и охлаждают со скоростью 0,1 - 0,2 град/мин до комнатной температуры.