Способ микроразмножения женьшеня

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 9) (1) 24 5)5 А О 1 Н 4/00 ОБРЕ Е ЕЛЬСТВ ГОСУДАРСТВЕ Н ОЕ ПАТЕ НТНОЕВЕДОМСТВО СССР(46) 30.06.93. Бюл, М 24 (71) Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения АН СССР(54) СПОСОБ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯЖЕНЬШЕНЯ (57) Использование: сельское хозяйство и биотехнология, в частности в селекции и семеноводстве женьшеня, Сущность изоИзобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии, в частности к селекции и семеноводству женьшеня.Целью изобретения является ускорение процесса размножения и круглогодичное получение бутонов,Сущность предлагаемого способа со стоит в том, что в способе клонального микрораэмножения женьшеня настоящего, включающего вычленение из соцветий бутонов, посадку их на питательную среду Мура- сиге - Скуга, содержащую ИНзчОз, КМОр, СаС 2 2 Н 20, М 9304 7 Н 20, КНгР 04, К 1, Нз 80 з, Мп 504 4 Н 20, 2 п 504 7 Н 20, йаМо 04 2 Н 20, Си 3045 Н 20, СоО 26 Н 20, теЯ 047 Н 20 йа 2 ЕОТА 2 Н 20 инозитол, никотиновую кислоту, пироксидин НО, тиамин НС 1, глицин, сахарозу и воду с добавлением 1,0 мг/л 2,4- Д, культивирование до образования эмбриогенных каллусов субкультивирование их бретения: микроклональное размножение женьшеня осуществляют путем вычленения цветочных бутОнов из соцветий, индуцированных предварительно при культивировании спящих почек корневища на питательной среде Мурасиге - Скуга, содержащей в своем составе 0,5 мг/л 6 - БАП и 0.5 мг/л ГКз Цветочные бутоны высаживают на питательную среду и культивируют до получения зрелых эмбриоидов, которые пересаживают на питательную среду Мурасиге - Скуга для индукции побега - и корнеобразования, содержащую половинное количество макроэлементов и дополнительно 4,0 мг/л 6 - БАП и 0,5 мг/л ГКз. 4 табл,на среде Мурасиге-Скуга с добавлением вместо 2,4 Д, 2,5 мг/л 6 - БАП и 2,0 мг/л АНУ до образования зрелых эмбриоидов, форми- -а рование из них укорененных побегов с по- Ср следующей высадкой в твердый субстрат, бутоны вычленяют иэ зачатков соцветий, полученных предварительной выгонкой изолированной покоящейся почки корневи ааюй ща маточного растения на среде МурасигеСкуга с добавлением 0,25 - 0,75 мг/л 6 - БАП и 0.025-0,75 мг/л ГКз. а формирование укорененных побегов осуществляют на модифицированной питательной среде Мурасиге-Скуга. в которой концентрация ЙН 4 ЙОз, КЙОз, СаС 22 Н 20, М 9504 7 Н 20. КН 2 Р 04 и сахарозы уменьшена вдвое, а в качестве регуляторов роста добавлены 0,05 мг/л ГКз и 3,5 - 4,5 мг/л - 6 БАП.Осуществляют способ следующим образом, 1 з)лрусо 1 окочщ Ся сО к. к 1)о,- Э же)Ь,ЕЛ )1 ОЭК; С "ГЛСРэ )т Е.ой ВОДОЙ, зэ Тесл РОДОп 1)О РОДОйобрэбэтьоэкГ 0,2/) рэсгоором ди)цидэ отечение 10 минузэтегл трижды 1 ромыоэютстерильной водой, У,сезлн., иципоо,ныхПОЧЕК УДаЛЯЮт НЭРУ КНЫЕ ЦОкРООНЕ ЧЕ,.СУИи остатки ткани корневища. Подготовленньсе почки помещэют в культурно,ныг сосуды на проавтоклавирооэннусо ин лциэпьнуюсреду. Инициэльнэя среда для онутрипочечного роста содержит кроме основной средыМурэсиге-Скугэ 0,25-0,75 мг/л 1; БАП и0,25-0,75 мг/л ГКз. Нэ этой среде о течеив1,5 мес, культивирования нэ свету при температуре 20 С и относ)гельно 1 олэж остиВОЗдуХа 40% ПрОИСХОдит ИЗМЕНЕ)ИОКро.ски покрооных почечных чешуй, р; скрьпиечешуй и выход зеленого побега, состсящ.гоиэ одного листэ, стебля, зэчэскэ соцьетия,Побег иэ культура ьссого го;удэ;сег;тс -чески це 1 вносят о чэшку 11 гр От с)ОГ.эотделяот соцветие и иэ него оыо;ня а) )1.ДЕЛЬНЫЕ бутОНЫ бЛЕДНО-ЗОЛЕНОЙ ОКро:К)лразмером до 1 мгл в дэогре, 1,эн:.Д,й бутон, ссредоэрительно сдэоио для уел;чецсляраненой поверхности, выса слсзэют о куль сур,)ЛЬНЫЙ СОСуд ц: ЛС)ухНнув ПИс;, СПЬ, ну).);се," нэ ко гори о:. 2, с0011 эз )е 1 ся .)лГ;рсГ)Гзь,й к с "ус т с 11;,г.с;1 0 м с Г, "О и и О 1с , э Г сс ,г х 1, У:е,1 Г).,з"/1: , 1; .и) Уп цс з )- ц,и н сегц .) с. 1 ц тес), с эр)),е 1 ьсспс Р:1 с)гт; 7 . с ",:ЦОЯРП С;ИГ ЭП): " 1 ТОг 11),),- Н)И,П .:) )с Ц), сгс, /, с,СЛ 1) .С),.-)- ,О )К 1)ЛС.с), К,;КУ")Н, ,;, )РО )Л; ос ;) 1Е,Е)с,культивлсс.1 оз). Н,) )ус сднрксзродып)оподобс.с эгл,:11 изс/сце стр,)кт. ) ,3 л 1)риогегссь кш)ус серз,Г;с .эси нэро.,ооую срс),у для /1,. сьс п со озрев- ни змб 1)иоидов .)э ср:,дс) .роле Оссвнепитэтеп,)ОЙ средьс сод сн,- 2 Б )Г/л сГЬАГ и 2,0 глг/и А 11 У, При кул-)инно;)деисэ 3 ОЙ срд нэ свесу ц)иг)Г)ерэГ)е20-С И ОН)СИтЕПЬНОЙ ОпвжНОСтй Н)З,70 ьпрсси.;О/.,ит дэль ессшэг /слфс 11 ессциэция эмбриоидных срук Гу 1. и через 1 слепскультивирования Об 1 рээуетсэглриогеснысКаппуС. СОДЕржащИй З 1 ЕЛЫЕ ЭГлор, ОИДЫ,Зрелые эмбрс,ослдс Пере.эживэют нэ реге.нерэционную пито Гельную среду,для одновременного ппу;ния побе Оо и ихукоренения, 31 э среда состоит из Оснооноисреды МурэсиГе Оку г, Р косорои .с цечтрэция КН )1 х 10 з, К 110 з,С С 1 21.1; С), 111";)1 л7 Н 20, К 1 Г Л И ,ЭХ 1 )ОЭ.с УГЕН,СЕ)."О9,5 м/) 1 К и З,5И ) и Г) ЬЮ 1 11) 3 ) ,1)ед " т).и 1 мес. упьти";. р . Ос из эмб 11 изи)1 г)зрмируется ПОчечкэ, из которой рээвипэ.тся нормальныерэс 1 есия имеюдив корень и цобег с однимИЛИ НЕССОЛКИЛИ ПИСТЬ 5)1 И,Рэссегя изолекэюг из культ/ральныхс,. Судг и оысэжиоают дпя адаптации в вермикупит пропиэнный питэтельной средойМурЭС 1 ГЕ-СкугЭ,П р и м е р. В совхозе "женьвень" Приморского края были отоб;эны элитные корни женьшеня цэстг) я ще о 5-летнегооозрэсга с хорош. оээвитыми покоящимипочками,15 Почки иэолирооэли, Кэждую из нихдважды промыв,. си глыльслой водой, затем -оздопроогдг)и )бэтыоэпи 0,2 " -м рэстООрОГЛ диц/Э И Е . НИЕ 10 Минут, ЗатЕМ511 кд-Г 1 помьсоэл) с Гг;рил По 1 водой. У20 дСЗ 1 Н 1) цроолцс Х ПОРК удлпяПИ НоружЫЕ ПОКОРНЫЕ Ч Шуй И ОСа 1 КИ тКаНИ КОрн.оиосэ. Для оь;б)ОГ)э концентраций1 е Гулят ср) н 11 с 1 э ц:0 хо)1 иссых для инициЭСИИ ОсТ 11 ЛНЕ ,1 ГО рОСта, ПОЧКИ раЗдЕ 25 пипи нэ груццы цо 10 шс о каждой,О делшсы почки иэ каждой групцы поменсэли о ку;сс,тура ьные среды, о которые на);вол 1 ц: 10 ь п Гроао 1 ок)сэоировэннои,сц. - с,;ПЕС Грдц;цГ)1, ИНИцИЭцИяГ ): ": .: р сэ, цри 1 одящэя к рдэоитиюОГ.э с,). Пб)ецсз ц бпюдэется при 0,25Г.; )П 5 С,;,)с 1,"ЭЗ;ТИ. ОГЕОР ц)1 ОИСХОДИТ15 цр бол.с г: сових;О с,.1 рэцичх б - Б)Г 1,со с онцт рэц" 0,71 гГ), с Гаглизирует.я колосто нный сьлод нормально разви 1 ых и; 11 ег; о, дс око ц ри с;он центрэцииБ.БА 1 бо)ссс: е," 0 5 м /с о рэзвитии побеГ:,э 0 гов нэблю)дется энцлэпии (поб, и с уродЛИВЫГИ ЛИСЛИ Ц/ИПИ ЗЭЧЭТКЭ 4 И,оцссетссс. 11 ибопьший выход нормальноРЭЗОИТЫХ ЦСоОН С ЗЭРЭГКЭМИ СОЦВЕтИй НЭзлюдэется при 0,5 м,л б БАП.При посте)нгой концентрации б -БАП -0,5 мг/л и иэменпюцсейсц величине конценсрац 1; ГК; нэГ.од;)и рззситсл нормэпьньх пг.егоо э и)сэг г;:це р;)ции ГКз1824114 5 10 20 25 30 50 аномалии (вытяивание и ослабление) при стабильном количественном выходе. Оптимальное сочетание в инициальной среде определяется: 6 -БАП и ГКз по 0,5 мг/л, Всего на этих вариантах инициальных питательных сред было получено 39 хорошо развитых зеленых побегов, состоящих из одного листа стебля и зачатка соцветия, Далее побеги из культуральных сосудов асептически перенесли в чашки Петри, Отделили от побегов соцветия. Из соцветий вычленили отдельные бутоны бледно;еленой окраски размером до 1 мм в диаметре, Для индукции самотического эмбриогенеза испольэовали бутоны, полученные от побегов инициированных на средах с разным содержанием 6-БАП и Гз, Критерием для отбора бутонов служило их нормальное развитие.Каждый бутон-эксплант, предварительно сдавив пинцетом для увеличения раневой поверхности, высаживали в кчльтуральные сосуды-пробирки дополненные 10 мл индукционной питательной среды, содержащей кроме основной пигательной среды Мурасиге-Скуга 1,0 мг/л 2,4 дихлорфеноксиуксусной кислоть (2,4 Д) (табл.1) Култивироване ро. од и в темноте при тем;ер г,г 20" огнос 1 ег; ой влажнос ги 70" Через 20% от, з культвчрования омои о у 60,( экспэ тс" дблюдали обрэзоалние кдллуса. Образа "зашибся на бутонааглусь и;е:и о 1 ос гсльно мягкую консис Г,."нциО светло-желтой ордски. В этот период они еще не имели типичных признаков эмбрногеной тканк (белый цвет, блеск, повышенная плотность). Через 2 месяца культивирования примерно 57;(, каллусов содержало зародншеподобные структуры. Полученные в результате культивирования на индукционной питательной среде, эмбриоге;ые кэллусы переносили в культуральные сосуды с 15"л ростовой среды, содержацей кро с основной пи гательной среды Мурасиге-Скуга 2,5 мг/л - 6 - БАП и 2,0 мг/л АНУ(табл.1). Культивирование проводили на свету при температуре 20 С и относительной влажности воздуха 70;(, Через 1 месяц сфзрчровэлиь эмбриогенные каллусы, содер .аие преимущественно зрелые э"бриоидыДля Форм 1 ровэния,корененных побегов зрелые эмбриоды переносили л культуральные сосуды обье,ом 50 мл, в которые наливали по 20 л ргнерационной питательной ср.ды вобл "од.оэщей модифицированную среду Мурасиге-Скуга с уменьшенным вдвое содержанием чН 4 йОз, КНОз Сэ С 22 Н 20, МдЯо 47 Н 20, КНР 04 и сахарозы (табл.) и различные концентрации 6 - БАП и ГКз (табл.З). Культивирование проводили на свету при температуре 20 С и относительной влажности воэдука 707(. В течение 1 месяца наблюдали изменения происходившие с эмбриоидами на разных вариантах регенерационной среды.На средах во всех вариантах происходила пролиферация, но только в узком интервале концентраций БАП и ГКз наблюдалось формирование почечки, из которой развива.лись нормальные растения. При этом изменение концентрации б - БАП выше или ниже оптимального значения 4,0 мг/л при концентрации ГКз 0,5 мг/л приводит к значительному снижению выхода растений-регенерантов. Регенеранты полученные при соотношенйи 6-БАП 0,5 мг/л и 4.0 мг/л ГКз выглядели очень ослабленными и вскоре погибли. То же и при 6 - БАП-О, ГК;-1,0 мг/л,Растения извлекали из культуральных сосудов и высаживали для адаптации в вермик., и г пропитанный питательной средой Мураси .-Скуга. При этом приживаемость растоий составляет до 100.В дог олнение к преимуществам предлагае.:го пособа, изложенным в материалах заявки, приводятся сравнительные данные по длительности этапов клонального микро- размножения женьшеня,формула изобретения Способ микроразмножения женьшеня включающий вычленение цветочных бутонов, культивирование их на питательной среде до образования зрелых эмбриоидов. пересадку их на питательную среду для получения побегов и их последующего укоренения, высадку полученных раста ий-регенерантов на твердый субстрат, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что цветочные бутоны вычленяют из соцветий, индуцированных предварительно при культивировании спящих почек корневища на питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей в своем составе 0,5 мг/л б-БАП и 0,5 мг/л ГКз, а для получения укорененных растений-регенерантов эмбриоиды пересаживают на питательную среду Мурасиге-Скуга с половинным содержанием макроэлементов дополнительно - 4.О мг/л 6-БАП и 0.5 мг/л ГКз.Соматическийзмбриогенез Состав основной среды Мурасиге-СкугвОбразование растении регенер Инициальнэя средаИндукционная среда Ростовая среда+ + + + + + + + + + + + 2,5 0,25-0,75 0,5 1,0 2,0 1 л Таблица 2 Влияние концентрации 6-БАП и ГЬ на инициацию внутридочечного роста;аблицаЗ Влияние различных концентраций БАП и ГКз на развитие эмбриоида4 бл заявокмес По прототипу месга ся почки нного кзлл с анка оящ 5 5 сего Составитель Ю,ЖуравлевТехред М.Моргентал Корректор М,Керецма дако яак эз 2200 ГирагкВНИИХИ Государств нного комитета по изоб113035, Москва, Ж, Рау м при ГКНТ ССС 101 тельский комбинат "Патент", г. Ужгор Г 3 роизводственно и.Га учение учение учение учение эбриоге азрелых эмбриоидовпобеговкооенненных побегов Подписноеретениям и открытшская наб., 4/5