Способ диагностики внутриутробного инфицирования ягнят бруцеллезом

)5 А 61 К 39/00 ОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНВЕДОМСТВО СССРГОСПАТЕНТ СССР) Б ТЕ ТОРС КОМ И ЕТЕЛЬСТ(57) И логич тения ного Одно сыво тиген в(71) Целиноградский сельскохозяйственныйинститут и Ставропольский сельскохозяйственный институт(56) Авторское свидетельство СССРМ 1289462, кл. А 61 В 10/00, 1984,. Авторское свидетельство СССРМ 1316679, кл. А 61 К 39/02, 1985,Изобретение относится к ветеринарии может быть использовано для иммунолоческой диагностики внутриутробного иницирования,Целью изобретения является иние точности способа диагностикиутробного инфицирования,Способ осуществляется следующим образом,У новорожденного сразу после рождения до кормления молозивом берут кровь изяремной вены и пробу первородного кала(меконий) иэ прямой кишки. Определяют наличие специфических антител к возбудителю в преколостральной сыворотке кровиноворожденного и антигенов патогена всуспензии мекония, При обнаружении вкрови новорожденного до кормления молозивом специфических антител и антигенов впробе мекония диагностируют внутриутробное инфицирование.Предлагаемый способ апробирован нановорожденных ягнятах из неблагополуч,.БЦ, ц 1813450 А 1(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВНУТРИУРОБНОГО ИНФИЦИРОВАНИЯ ЯГНЯТ БРЦЕЛЯ ЕЗОМ спользование: ветеринария, иммун еская диагностика, Сущность изобр : для диагностирования внутриутро инфицирования ягнят бруцеллезо временно с определением антител отке крови проводят определение а ов в первородном кале, 2 табл. ных по бруцеллезу отар и поясняется следующими примерами,П р и м е р 1, Для определения наличияспецифических антител в преколостральнойсыворотке крови ягнят с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) на полистиро- аловую 96-луночную панель для рмикротитрования сорбируют единый бруцеллез ный анти ген в разведении 1:100 в 100микролитрах (мкл) забуференного физиологического раствора(ЗФР) рН 7,2-7,4 при 40 С Фв течение ночи. Затем панель отмывают 3 СЛраза ЗФР с 0,05% твином(ЗФР-Тв) и 3 (.)раза ЗФР, готовят в лунках панели двукратные разведения преколостральной сыворотки крови (1;2 и выше) в объеме 100 мкл РфЗФР-Тв. После инкубации в течение 1,5 ч фпри 37 С панель отмывают описанным способом и в лунки вносят антитела кроликапротив иммуноглобулинов овцы, меченныепероксидазой, в рабочем разведении вЗФР-Тв. Через 1 ч после инкубации при37 С повторяют процедуру отмывки с цельюудаления несвязанных продуктов реакции,а количество связавшегося фермента, а значит, и антител против бруцеллеэного анти- гена определяют количественно по распадусубстрата - Н 202 в присутствии хромогенаортофенилендиамина. Положительная реакция характеризуется коричневым окрашиванием и просчитывается на фото- метре при длине волны 492 нм. Превышение оптической плотности в 2 раза и более в лунках с испытуемыми сыворотками надконтролем оценивается как положительная реакция.П р и м е р 2. По примеру 1 были исследованы преколостральные сыворотки крови123 ягнят, полученных от овцематок неблагополучной отары по бруцеллезу. Из общегочисла обследованных ягнят у 45,5 животных в крови обнаружены антитела к бруцелпам, Результаты ИФП сывороток крови 30 новорожденных, представлены в табл,1.Как видно из табл,1, титры, противобруцеллезных антител в крови новорожденныхбыли различными, Так например, если у ягнят под инвентарными номерами 3041, 3001, 3082 и 3067 титры антител были одинаковыми 1:2, тогда как с особей под номерами 3081, 3005, 3014 и 3051 значения названного показателя составили соответственно 1:8, 1:256, 1;2048 и 1:8192. Полученные данные указывают на нарушения функции плацентарного барьера, имевшиеместо в период суягности и возможностьинфицирования плодов гематогенным путем.П р и м е р 3, Для исследования пробы мекония в ИФА на наличие бруцеллезного антигенэ ее заливают 0,85%-ным растворомМаС в соотношении 1:10, гомогенезируют, прогревают 15 мин при 100 С в водяной бане, центрифугируют 10 мин при 2000об/мин и надосадочную жидкость используют в качестве исследуемого образца.На полоску нитроцеллюлозной бумаги(45 х 5 мм) в 8-ми точках наносят раствор монокпональных антител (МонАт), против антигенов бруцелл, в двукратно убывающей концентрации начиная с 160 мкг/мл в количестве 1 мкл. (В работе были использованы полученные нами МонАт, продуцируемые "Штаммом гибридных культивируемых клеток животных Мцз МцзсццзЕ - продуцентмоноклональных антител к бактериям родаВгцсеПа" Авт,св,1604848, опублик, Бюп,41, 1990 г.). Свободные участки носителя блокируют 1 обычьим сывороточным альбумином в ЗФР при 37 С 1 ч. Затем полоску отмывают по 3 раза ЗФР-Тв и ЗФР и инкубируют при 37 С в течение 1 ч в исследуемом образце, Повторяют процедуру отмывки и носитель переносят в раствор МонАт, меченных пероксилаэой, и инкубируют при 37 С 1 ч. После тщательной отмывки полоску переносят в раствор субстрата -Н 202 в присутствии 4-хлор-нафтола им вы 5 держивают в течение 3-5 мин. Затем отмывают дистиллированной водой ивысушивают на воздухе, Положительная реакция, которая отмечается в случае присутствия в образцах бруцеллезного антигена,10О характеризуется появлением на местах нанесения МонАт серо-фиолетовых точек.П р и м е р 4, По примеру 3 были анализированы 123 пробы мекания ягнят из числаисследуемых по примеру 2 и установлено15 наличие бруцеллезного антигена в первородном кале у 65,8 оноворожденных, Результаты ИФА первородного кала 30животных в сравнении с анализом сывороток крови, полученным по примеру 2, пред 20 ставлены в табл,2,Как видно из табл.2, у 17 новорожденных выявлены как антигены бруцелл в пробахпервородного кала, так и специфические антитела. Полученные данные свидетельствуют о том, что отсутствие специфическихантител преколостральной сыворотке кровиноворожденного не служит доказательством не инфицированности плода. Так,например, у 2 голов при рождении в кровиЗО отсутствовали противобруцеллезные антитела, однако в пробах мекония выявленыантигены бруцелл. Данный пример указывает нэ заражение плода при нормальномфункционировании плацентарного барьера35 путем проглатывания инфицированной амниотической жидкости. У 9 голов не выявлены антигены возбудителя, однако всыворотке крови имелись специфическиеантитела к бруцеллам, что является доказа 40 тельством повышенной проницаемости плаценты и инфицирования плодагематогенным путем,Способы диагностикиинфекционныхболезней, основанные на обнаружении ан 45 тител, известны и широко используются вмедицинской и ветеринарной практике, Однако обнаружение антител у новорожденных сельскохозяйственных животных ещене свидетельствуют об инфицированности50 организма, поскольку зти антитела могутбыть материнского происхождения, Есливзятие крови у новорожденного будет осуществляться после скармливания молозива,то в сыворотке крови могут обнаруживаться55 антитела материнского происхождения.Предлагаемый способ отличается тем,что пробы крови у новорожденного берутсядо первого кормления молозивом, Этоочень важно, поскольку у сельскохозяйственных животных с десмохориэпьным и1813450 Таблица 1 зпителиохориальным типом плацентации антитела через плэценту в организм плода не проникают, Обнаружение антител в крови у новорожденного до первого кормления молозивом свидетельствует о нарушении 5 плацентарного барьера, трансплацентарном проникновении пассивных антител или возбудителя и синтез специфических антител организмом плода.Важным отличительным признаком 10 предлагаемого способа является и то, что по этому способу проводятся также исследования первородного кала на наличие антигенов возбудителя, Обнаружение антигена является непосредственным доказательст вом инфицирования плода,Комплексное определение в преколострэльной сыворотке крови антител и в первородном кале антигенов возбудителя также . является важным отличительным призна ком, поскольку позволяет более достоверно выявлять животных, инфицированных в фетальный период развития.Существенным признаком предлагаемого способа является и то, что для обнару жения антигенов возбудителя использовались не поликлональные сыворотки, э моноклональные антитела высокой специфичности, что позволяет исключить ошибки, обусловленные реагированием ан тител с родственными энтигенами различных возбудителей.Отличительные признаки, характерные 35 предлагаемому способу, являются весьма существенными, а их совокупность позволяет значительно повысить точность диагностики, Доказательством существенности 40 признаков является непосредственное обнаружение антигенов возбудителя в организме новорожденного.Основанием для суждения о внутриутробном инфицировании по известному спо собу является 4-кратное превышение титров антител у новорожденного по сравнению с материнским организмом. Действительно, антитела образуются в организме в ответ на действие антигенэ, Однако синтез антител и накопление их в крови зависит от многих факторов: дозы антигенэ и кратности его поступления, состояния иммунной системы, условия кормления, содержания и многих других, Поэтому они являются косвенным показателем инфицирования,Предлагаемый способ основан нэ обнаружении антигенов возбудителя в организме новорожденного, т,е. прямого показателя инфицирования,Эффективность диагностики обусловлены комплексным определением в организме как специфических антител, так и антигенов возбудителя. Результаты исследований (см,табл.2) свидетельствуют о том, что встречаются животные (3044, 3078) в сыворотке которых антитела отсутствуют при наличии антигена в организме, Также имели место случаи, когда антиген отсутствовал, а антитела обнаруживались в диагностических титрах (3005, 3081, 3029, 3006, 3049, 3069, 3041, 3001), Комплексное обнаружение в организме антител и антигенов возбудителя позволяет избежать диагностических ошибок и своевременно принять меры по профилактике болезни у новорожденных,Эффективность диагностики повышена также за счет использования моноклональных антител, Последние обеспечили повышение чувствительности реакции по обнаружению антигенов до 1 нг/мл,Формула изобретения Способ диагностики внутриутробного инфицирования ягнят бруцеллезом путем определения антител в сыворотке крови, о тлича ющийся тем,что,сцельюповышения точности способа, одновременно с определением антител в сыворотке крови проводят определение антигенов в первородном кале.1813450 Продолжение таблицы 1 Примечание. За значение оптической плотности (ОП) контроля взят средний показатель ОП 10 проб преколостральных сывороток новорожденных ягнят благополучной по инфекционным и незаразным болезням опары по аналогичной схеме постановки ИФА.0 - специфические антитела не обнаружены,Таблица 2 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 3007 3027 3001 3034 3024 301,5 3008 3003 3081 3082 3033 3078 3029 3006 3053 3049 3067 3036 3026 3004 3050 3069 Конт оль 0,528 0,609 0,339 0,161 0,479 0,560 0,492 1,005 0,360 0,365 0,632 0,144 0;359 0,348 0,631 0,533 0,438 0,518 0,103 0,981 0,408 0,332 0,153 1:128 1:1024 1:2 0 1:25610 1813450 Продолжение таблицы 2 Составитель И.КрушинаТехред М.Моргентал Корректор А.Обручар Редактор Заказ 1795 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 Примечание. В качестве контрольного образца использовались пробы меконий новорожденных ягнят благополучной по инфекционным и незаразным болезням отары,. Чувствительность использованного ИФА по отношению к бруцеллезному антигену соста вила 1 нг/мл.