Способ селекции популяции клеток in vivo

, спосоизнаков холевых го теста. внутри- нимальо теста, кциониология ных пр ра опу ядерно ирают ы с ми дерног ок селе ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт разведения и генетики животных и Институт цитологии АН СССР (72) В,Ю.Кравцов, А,Ф.Яковлев, Е.В,федорова и Ю.Б.Вахтин(56) Вахтин Ю.Б. Генетическая теория клеточных популяций, Л.: Наука, 1980, 166 с.Копнин Б.П. Генетика, 1981, 18 с.308-317.Кравцов В.Ю. Гуксова И,В., КалинскаяЕ.В., Швинских Н.Н., Вахтин Ю.Б. Генетика, 1990, 26, с. 1584-1590. Изобретение относится к биотехнологии, а точнее к способам изменения наследственных признаков клеточных линий,Целью изобретения является снижение кариотипической нестабильности популяций клеток миелом,Сущность известного способа, взятого в качестве прототипа, заключается в следующем: путем внутривенной инъекции получают легочные экспериментальные метастазы уницеллюлярного происхождения рабдомиосаркамы крыс; полученные метастазы анализируют микроядерным тестом (МЯТ), отбирают один экспериментальный метастаз с максимальной частотой клеток с микроядрами, получают из него суспензию для внутривенного введения с целью реклонирования. Выросшие экспериментальные метастазы-потомки подвергаются выше описанной процедуре, т.е. оценке МЯТ, отбору одного клона с максимальным показа(54) СПОСОБ СЕЛЕКЦИИ КЛЕТОК й ЧЧО(57) Использование: биотехн бы изменения наследствен клеточных линий путем отбо узлов по показателям микро Сущность изобретения. отб брюшинные опухолевые узл ными показателями микроя полученные популяции клет руют. 1 ил. телем МЯТ, получению из него суспензии для последующего внутривенного введения с целью реклонирования. Таким образом, отбор идет по одному экспериментальному метастазу на фоне реклонирования.Известный способ-прототип применяется с целью изучения. корреляции между степенью нестабильности кариотипа злокачественности популяций опухолевых клеток.В результате. применения известного способа селекции на повышение частоты спонтанного образования микроядер в клонах экспериментальных легочных метастазов перевивной рабдомиосаркомы крыс удалось получить популяцию клеток с достаточно большей частотой клеток с микроядрами и достоверно меньшим метастатическим потенциалом (степенью злокачественности). Установлена отрицательная зависимость между степенью нестабильности кариотипации В связи с этим существует необходимость получения клеточных популяций миелом с пониженной частотой спонтанной кариотипической изменчивости.По причине наследственной гетероген 40 ности в популяциях клеток перевивных линий по признаку "спонтанная частота клеток с МЯТ" авторы предлагают проводить искусственный отбор, направленныйна снижение спонтанной частоты клеток с 45 микроядрами. В ходе отбора установлено достоверное снижение частоты спонтанного образования микроядер в клетках, что является показателем снижения степени ка 50 риотипической изменчивости в популяциях клеток миелом.Сущность заявленного способа заключается в том, что мышам линии ВА 1.В/с инъецируют внутрибрюшинную суспенэию клеток миеломы, получают внутрибрюшинные (в/б) опухолевые узлы, анализируют их методом МЯТ, отбирают в/б узлы с минимальными показателями МЯТ; получают иэ них суспенэию для очередного цикла отбора,и степенью злокачественности в популяциях опухолевых клеток.Известно, что в ходе опухолевой прогрессии степень нестабильности кариотипа клеток возрастает, а также сохраняется на 5 высоком уровне при пассировании опухолевых клеток линий 1 и ч 1 чо и 1 и ч 1 тго.В литературе не известны работы по проведению искусственного отбора, направленногб на снижение частоты спонтан ных нарушений кариотипов в популяциях перевивных клеточных линий.Целью изобретения является снижение степени кариотипической нестабильности . популяций перевивных клеточных линий 15 миелом мышей, т.е. получение популяций клеток миелом с относительно стабильным кариотипом и, следовательно, со стабильным фенотипом, используемых .в дальнейшем для получения гибридов-продуцентов. 20Известно, что при использовании в гибридомной технологии миелом, не,тестированный на стабильность кариотипа, наблюдается высокая степень.кариотипической нестабильности и низкая эффективность 25 секреции. гибридом. Вследствие нестабильности, несбалансированности кариотипа, элиминация хромосом с желаемыми генами может проходить с высокой частотой.Одной из причин кариотипической не стабильности гибридов-продуцентов является изначальная кариотипическая нестабильность клеток перевивных линий, взятых в качестве партнеров для гибридизаВ качестве опухоленосителей при селекции заявленным способом могут испсльзоваться мыши других линий.Критерием способа является спонтанная частота возникновения клеток с микроядрами. Но при селекции по высокойспонтанной частоте возникновения клеток смикроядрами (в способе-прототипе) - повышается степень злокачественности клеток истепень кариотипической нестабильностиПри селекции на снижение частоты возникновения клеток с микроядрами (заявленным способом) в результате 4-х цикловотбора получают популяции клеток миеломы о достоверно высокой стабильностьюкариотипа (до 0,60% изменчивости ка риотипа), т.е. получают клетки иного качества, обладающие стабильными фенотипическимисвойствами, представляющие большой интерес для гибридомной технологии.Отличительными признаками заявленного решения являются следующие признаки.внутрибрюшинная инъекция мышей линии ВА 1.8/ с суспенэией клеток миеломы. Линия ВА 1 В/с является сингенной линией для получения конкретной миеломы ЗР 2/О, которая используется для получения гибридом;оценка и отбор внутрибрюшинных опухолевых узлов с минимальными показателями микроядерного теста для последующегореклонирования;получение суспензии из отобранных узлов для очередного цикла отбора,Существенным признаком является отбор внутрибрюшинных узлов с минимальными показателями микроядерного теста. В результате 4-х циклов отбора по этому критерию получают потомство популяции клеток миеломы, имеющее достоверно низкую частоту клеток с микроядрами (до 0,60% в среднем по популяции), В исходной же популяции средняя частота клеток с микроядрами составляет 2,1% (с изменчивостью от 0,6 до 5,3%).Преимуществом отбора внутрибрюшинных узлов передлегочными метастазами заключается в следующем: в их высокой скорости формирования (7-14 суток) и достаточном количестве для проведения популяционного теста и отбора.Легочные метастазы формируются в течение 30 дней и более, и количество их значительно и недостаточно для проведения селекции.Кроме того, при отборе внутрибрюшинных узлов после нескольких циклов отбора получают популяции клеток миеломы с достоверно стабильным кариотипом и, следоНа чертеже йоказана частота клеток с микроядрами (ЧКМ) во внутрибрюшинных узлах перевивной миеломы ЗР 2/О,По оси абсцисс - частота клеток с микроядрами (Ч КМ), . По оси ординат - число внутрибрюшинных узлов, %, а - 40 в/б узлов до отбора; б - 20 в/б узлов после 1-го цикла отбора: в - 26 в/б узлов после 2-го цикла отбора; г - 33 в/б узла после 3 цикла отбора; д - 25 в/б узлов после 4 цикла отбора, направленного на снижение спонтанной ЧКМ в в/б узлах. 5055 вательно, стабильными фенотипическимипризнаками, обеспечивающими высокуюжизнеспособность клеток, и при использовании их для получения гибридом - стабильную секрецию антител, 5Таким образом, в результате селекциипо признаку низкой спонтанной частотывозникновения клеток с микроядрами вкаждом последующем поколении популяции клеток миедомы. происходит снижение 10степени спонтанной частоты возникновения клеток с микроядрами, т.е, снижениестепени кариотипической нестабильности истепени элокачественности клеток, Селекция клеток заявленным способом позволяет 15снизить частоту встречаемости клеток смикроядрами в 3 и более раз, что свидетельствует о повышении жизнеспособности клеток и о высокой стабильности их кариотипа,что является целью изобретения. 20Известным же.способом изучается и определяется степень злокачественности исвязь ее с нестабильностью кариотипа вполучаемых популяциях клеток, не представляющих интереса для гибридомной биотехнологии из-эа их нестабильныхфенотипических свойств, обусловленныхнестабильностью кариотипа,В способе-прототипе проводится отбородного метастаза с максимальной частотой 30клеток с микроядрами и в результате нескольких циклов отбора установлено возрастание степени нестабильности кариотипаи степени элокачественности клеток, т,е.обеспечивается получение популяции клеток с высокой спонтанной частотой возникновения микроядер.Использование отселектированных заявляемым способом на стабильность кариотипа клеток миелом при получении 40гибридом повысит уровень селекции гиб.ридом, что даст в итоге экономию в народном хозяйстве,Предлагаемый способ может применятьсяна предприятиях биотехнологической, медицинской промышленности и в научно-исследовательских целях,П р и м е р. Отбор в/б узлов миеломы ЗР 2/О проводили по следующей схеме. Вычлененные из брюшной полости декапитированной мыши 40 в/б узлов (в/б узлы фиксированы на кишечнике и брызжейке) отдельно помещают в лунки иммунологического планшета (ТУ 64-2-279-79) со средой 199.Узелки достают иэ лунки и методом отпечатков делают мазки на стерильном предметном стекле (около 1000 клеток на 1 предметное стекло), пронумерованном соответственно номеру лунки.Оставшуюся часть в/б узлов помещают обратно в лунку, планшет закрывают и помещают в холодильник при +4 С на 8-12 ч, Приготовленные мазки фиксируют 96; этиловым спиртом с течение 5 мин, высушивают, окрашивают азур-зозином (в соотношении 1 часть 0,1 зоэина на 3 части 0,1 аэура, разбавленного в 50 раз дистиллированной водой) в течение 10 мин.Затем проводят микроядерный тест под иммерсией (окуляр 10, объектив 100). В каждом мазке методом МЯТ анализируют по 300 клеток, Частоту клеток с микроядрами выражают в процентах. Средняя частота клеток с микроядрами (ЧМК) в исходной выборке из 40 в/б узлов составила 2,1, размах изменчивости от 0,6 до 5,3 (чертеж). Из исходной популяции отбирают узлы с минимальными показателями МЯТ, имеющие от 0,6 до 1,0 клеток с микроядрами. Из них готовят суспензию для в/б инъецирования, для чего их помещают в стерильные флаконы (бак-печатки), гомогенизируют с помощью ножниц, заливают 5 мл универсальной среды ТСи пипетируют шприцем в течение 3 мин.Полученную суспензию фильтруют через 4 слоя стерильной марли в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин. Надосадок сливают. К полученному осадку клеток добавляют 3 мл среды ТС, определяют концентрацию клеток с помощью камеры Горячева и доводят концентрацию до 3 млн, клеток/мл, Подготовленную таким образом суспензию клеток миеломы инъецируют внутрибрюшинно мышам линии ВА 1 В/с в дозе 1мл/особь.Через 12 суток появляются признаки внутрибрюшинного асцитного роста (видимое увеличение области живота животного). Вскрывают брюшную полость, отпрепаровывают сформировавшиеся опухолевые узлы, помещают их в лунки иммунологического планшета со средой ТС, делают мазки, проводят оценку методом МЯТ, анализируя по 300 клеток каждого иэ 20 исследуемых в этом цикле в/б узлов, определяют частоту клеток с микроядрами, Средняя частота клеток с микроядрами в результате 1-го цикла отбора составила 1,1 (чертеж). Отбирают 5 узлов с минимальными показа телями МЯТ, имеющих от 0,3-0,6 клеток с микроядрами и используют их для очередных в/б прививок во 2-ой цикл отбора. Таким образом, описанные выше манипуляции повторяются на каждом цикле отбора. 10В результатедвух циклов отбора средняя частота клеток с микроядрами понизиласьдо 0,89%, а размах изменчивости сузился (в 1 п - 0;, вах - 3 ) (чертеж). Пять из 26 исследованных в/б узлов с минималь ными показателями МЛТ(от О до 0,3) были отобраны для 3-го цикла отбора.В результате 3 цикла отбора, проведенного методом, описанным выше, средняя частота клеток с микроядрами в популяции 20 ЗЗ в/б узлов составила 0,75 (чертеж). В очередной, четвертый цикл отбора были взяты в/б узлы, имеющие 0 клеток с микроядрами.Четвертый цикл отбора также оказался 25 эффективным: средняя частота клеток с микроядрами в выборке иэ 25 в/б узловсоставила всего 0,607, 56 в/б узлов имели показатели микроядерного теста не более 1(чертеж).Таким образом проведены 4 цикла искусственной селекции популяций клеток миелом на снижение степени частоты клеток смикроядрами (кариотипической изменчивости). Частота встречаемости клеток с микроядрами в полученных путем заявляемого .способа селекции популяциях клеток миелом снизилась с 2,1 до 0,60 ф, т.е. в 3 слишним раза (при Р0,001 по непараметрическому критерию Вилкоксона-МаннаУитин),Ф о р мул а и зоб ретен и яСпособ селекции популяции клетокичиччо, включающий экспресс-анализ частотымикроядер в опухолевых узлах, отбор опухолевых узлов с их дальнейшей перевивкой,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюснижения степени кариотипической нестабильности популяции клеток миелом, отбирают внутрибрюшинные опухолевые узлы сминимальными показателями микроядерного теста,, Ходакова рЕкто КТО К Зак Уж горо Га раиэаОдСтВЕ аз 966ВНИИПИ Госуда Составитель В. Кравц Техред М.Моргентал Тираж Подписное венного комитета по изобретениям и открытиям 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 здательский комбинат "Патент