Способ осаждения ванкомицина (основания)

ОЮЭ СОВЕТСКИХОЦИАЛИСТИЧЕСКИХЕСПУБЛИК 1760970 А 9) НИЕ ПИ РЕТЕНИЯ К ПАТЕН ани (ОЯ)тт и Гарольд Бер 099,ИЯ ВАНКОМИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР(71) Эли Лилли Энд Ком(72) Гарольд Рэймонд Кнард Хэйс (ОЗ), НА (ОСНОВАНИЯ) Изобретение относится к области производства антибиотиков, в частности, к способу осаждения ванкомицина,Вследствие проявляемого к ванкомицину интереса и его важности ведется непрерывный поиск более эффективных способов выделения антибиотика из его ферментационных смесей,Ванкомицин представляет собой продукт ферментации. Обычно ферментационный бульон фильтруют, фильтрат подкисляют и пропускают через один или несколько слоев хроматографической смолы с целью вызвать отделение фракций с . антибиотической активностью. Добавление при перемешивании основания рН элюата, содержащего очищенный антибиотик, устанавливают в пределах 8-8,2. Осаждение ванкомицина (основания), как поавило, начинается при рН 7.2-7,5, т,е. еще до достижения необходимого значения рН. Взвесь А 61 К 35/70, С 12 Р 1/02(57) Использование; способы получения антибиотиков, в частности ванкомицина.,Сущность изобретения: осуществляют взаимодействие раствора ванкомицина с раствором гидроокиси натрия при добавлении одного из них к другому при перемешивании в течение 10 с - 2,5 мин и до достижения рН в смеси 7,8-8,24, после чего перемешивание прекращают и смесь отстаивают, Процесс ведут при 10 - 30 С. В результате получают легко фильтруемцй осадок ванкомицина (основания). 1 з.п. флы, 4 табл,кристаллов перемешивают с непрерывнымрегулированием рН до необходимого значения до момента полного осаждения. Этимспособом достигаются невоспроизводимыевыхода, происходит непредсказуемое осаждение и образование неравномерно трудно Сфильтрующего осадка (1),Трудности, возникающие при фильтровании взвесей ванкомицина (основания) ( )представляют пробивку при промышлен-ном получении ванкомицина, существую-щую уже около двадцати лет,Целью изобретения является улучшение качества осадка.Было обнаружено, что если осажаениеванкомицина (снования) задержать до момента установления рН раствора по меньшей пере 7,8 и завершать осаждение безперемешивания, в этом случае происходитнепрерывное образование продукта в видехорошо сформированных больших пласти 176097050 нок, Такие пластинки могут быть легко отфильтрованы на воронке Бюхнера с помощью центрифуги или фильтрпресса. Кроме того, при этом увеличиваются выхода продукта и улучшенная фильтруемость продукта позволяет обрабатывать растворы с более высокой концентрацией ванкомицина, что также увеличивает выход ванкомицины на загрузку и улучшает эффективность процесса.Описываемый способ настоящего изобретения заключается в быстром соединении водного раствора ванкомицина с водным раствором основания с получением раствора со значением рН перед осаждением по меньшей мере 7,8 и последующим продолжением осаждения без перемещения. Выражение "значение рН по меньшей мере 7,8" означает минимальное значение рН, при котором использование статической технологии осаждения приводит к хорошо сформированным, легко фильтруемым пластинкам ванкомицина (основания). При высоких концентрациях ванкомицина оказывается возможным получать такой осадок при таких низких значениях рН как 7,5, если при этом раствор не перемешивать. Однако, в этих условиях осаждение не бывает полным и выхода снижаются. Увеличение рН до 9 влияет на стабильность ванкомицина, при этомснижаются выхода и образуются обесцвед ченные продукты. Наилучшие результаты достигаются при начале осаждения в интервале значений рН 7,8 - 8,24. Рекомендуется , устанавливать рН 7,8 - 8,24 и прекращать перемешивание доначала осаждения.В одном из вариантов изобретения значение рН элюированного концентрата ванкомицина устанавливают в пределах 6,5 - 7 добавлением основания, т.е. соединения, образующего в водном растворе ионы гидроксила, такого как гидроксид натрия, гидроксид калия и т.п, Отбирают аликвотное количество, которое титруют с целью определения количества основания, которое необходимо добавить до повышения рН по меньшей мере до 7,8; Вычисленное количество основания быстро и при перемешивании добавляют с элюированному концентрату до рН по меньшей мере 7,8 до начала осаждения.Перемешивание прекращают сразу же после добавления основания и раствор оставляют отстаиваться. Рекомендуют основание добавлять с такой скоростью, чтобы при этом устанавливать рН 8-8,24, и перемешивание прекращалось. В результате получают большие хорошо сформированные и легко фильтруемые пластинки продукта.В другом варианте изобретения р Н элюированного концентрата устанавливают в 5 10 15 20 25 30 35 40 45 пределах 6,5-7, Раствор быстро при перемешивэнии добавляют к раствору основания соответствующей концентрации с получением конечного значения рН по меньшей мере 7,8. Раствор основания может быть буферным, Перемешивание прекращают сразу же после прибавления элюированного концентрата, И в этом случае вновь рекомендуется, чтобы элюат добавлялся в полном обьеме и чтобы конечное значение рН было в интервале 8 - 8,24. И в этом случае получают большие, хорошо сформированные и легко фильтруемые пластинки продукта,На скорость осаждения влияет температура раствора. Рекомендуется, чтобы температура раствора была 10 - 30 С, При температуре раствора выше 30 С осаждение часто начинается прежде, чем рН достигнет значения 7,8, и полученнай в результате ванкомицин (основание) трудно поддается фильтрованию, Напротив, при температуре ниже 10 С осаждение происходит медленно и через два часа завершается менее чем наполовину, Таким образом, кристаллизацию рекомендуется проводить при температуре 10 - ЗОЛ С, наиболее предпочтительное при 20 - 25 С, с получением легко фильтруемого осадка в. течение приемлемого с промышленной точки зрения времени.На скорость осаждения также влияет концентрация ванкомицина.в элюате, Рекомендуется, чтобы элюированный концентрат содержал 75-200 мг/мл ванкомицина, наиболее предпочтительно 85-160 мг/мл. В целом, чем выше концентрация, тем быстрее идет осаждение и тем оно более полное, При более высоких концентрациях может возникнуть необходимость в регулировании рН при 20 С или ниже с целью избежать преждевременного осаждения ванкомицина (основания). Затем температура может быть повышена до 25 С с целью завершения осаждения. Осаждение ванкомицина (основания) из растворов с концентрацией менее 75 мг/мл происходит более медленно и приводит к продукту, фильтрующемуся более медленно по сравнению с более концентрированными растворамиП риме р 1.Аликвоты элюированного концентрата.: по 440 мл, содержащие 75 мг/мл ванкоми-цина, доводят до рН 7 добавлением при перемешивании 3 н раствора гидроксида натрия. Затем р Н повышают от 7 до 8,24 добавлением в течение 75 секунд Зг раствора гидроксида натрия. Перемешивание прекращают сразу после добавления гидроксидэ натрия. Через 1,5 минуты начинает осаждатьсяванкомицин (основание), Температуру раствора поддерживают при 25 С. Степень кристаллизации контролируют с помощью ультрафиолетового анализа, Примерно через 6 часов взвесь фильтруют нэ воронке Бюхнера диаметром 1,25 дюйма (3,2 см), снабженной стеклянной колонкой, под давлением 0,984 ат. Фильтровальный пирог промывают 105 мл 50-го водного метанола и затем 105 мл метанола, Время фильтроьания - 7,5 мин, первое промывание занимает 11 мин, второе промывание - 9 мин. Выход ванкомицина (основание) 90;,Пример 2 - 5,Воспроизведена методлка примера 1 с использованием элюируемого концентрата, содержащего 90, 120 и 160 мг/мл ванкомицина. Осаждение из раствора с 160 мг/мл ванкомицина проведено дважды. В ходе первого опыта при регулируемой температуре 25 С осаждение начинается гри рН 7,9, Перемешивание прекращают после добавления всего аликвотного количества гидроксида натрия (рН 8,24). В втором опытетемпература элюата - 10 С, температура раствора гидроксида натрия - 15 С, температура кристаллизации в результате достигает 210 С, Перемешивание прекращают сразу же после добавления раствооа гидроксида натрия, рН 8,23. Осажденле начинается спустя 35 - 40 секунд,Полученные в примерах 1 - 5 результаты суммированы в таблице 1,Примеры 6-9.Воспроизведена методика примера 1 с использованием элюированного концентрата, содержащего 83,7 мг/мл ванкомицина, и изменением температуры. Полученные результаты суммированы в таблице 2, Впримере 9 при 30 С осэждение нацалось прежде, чем весь раствор гидроксида натрия был добавлен.Пример 10.К аликвотному количеству на 200 млэлюированного концентрата, содержащего 74 мг/мл ванкомицина, добавляют мочевину (14,8 г). Добавлением 33 мл 3 н раствора гидроксида натрия устанавливают рН 6,5. Полученный раствор в течение 10-15 секунд при перемешивании прибавляют к 30 мл 3 н раствора гидроксида натрия, содержащего 2,5 г ацетата натрия, и перемешивание сразу же прекращают, Полученный раствор имеет рН 8, Температуру раствора поддерживают при 25 С. Осаждение ванкомицина начинается соазу же, Через 30 Мин взвесь фильтруют на воронке Бюхнера диаметром 9 см. Фильтровальный пирог промывают 100 мл 50 ,-го водного метанола с последующим повторным. промыванием 100 мл ме 5 10 15 20 30 40 45 50 55 танолэ. Время фильтрования - 1,9 мин, первое промывание занимает 2,6 мин, второепромывание - 2,6 мин. Выход 95 оь.Примеры 11 - 14.Воспроизведена методика прлмера 10при использовании различных количествмочевины и ацетатэ натрия, В некоторыхслучаях для второго промывания используют метанол, а для третьего промывания -ацетон,Для сравнения 200 мл взвеси кристаллов, полуценной по известной методике изэлюата, содержащего 73 мг/мл ванкомицина, фильтруют на воронке Бюхнера диаметром 9 см,Результаты примеров 10 - 14 суммированы в таблице 3,Пример 15,Добавлением гидроксида натрия (19 ОС)в 750 л элюированнаго концентоата (15 С),содержащего 85 мг/мл ванкомицина, устанавливают рН 7. Аликвотное колп ествотитруют до рН 8,2 и рассчитывают количество3 н раствора гидроксида натрия, необходи 5 мое для установления в элюэте значения оН8.2, Рассчитанное количество (56 л) из находяще. ося под давлением сосуда в течение2,5 мин выдувают в резервуар и перемешивание прекращаю". Осадение начинаетсяпрежде, чем все количество гидроксида натрия оказывается добавленным. Температуру раствора стабилизируют при 25 С. Через4;5 часа взвесь фильтруют с помощьюфильтр-пресса. Фильтровальный пирог про 5 мывают водой до понижения проводимостиниже 3000 мкм ом (примерно 1300 л), послечего повторно промывают ацетоном (950 л),Время флльтрования - 10 мин, первое промывание занимает 15 мин, второе промывания - 7 мин, выход 924.При мер ы 16 17Воспроизведена методика примера 15,за исключением того, что гидрсксид натрияприбавляют за 1,5 мин и осаждение начинается через 15 секунд после завершения поибавления,Результаты примеров 15 и 16 сравнивают со средчим временем фильтрования длятрех опытом, проведенных по известной методике с использованием элюата, содержащего 75 й 15 мг/мл ванкомицина.Результаты примеров 15-17 суммированы в таблице 4,Ф о р мул э и зоб ретен ия1. Способ осаждения ванкомицина (основания), предусматривающий взаимодействие раствора, содеркащего ванкомицин,с раствором гидроокиси натрия, о т л и ц а ющ и й с я тем, что, с целью улучшения качества осадка за счет повышения его способно1760970 Таблица 1 Результаты осаждения ванкомицина Таблица езультаты осаждения ванкомицина сти к фильтрованию, используют раствор ванкомицина с концентрацией 60 - 100 мгlмл и взаимодействие реагентов осуществляют при добавлении одного из них к другому при перемешивании в течение вре Осаждение начинается при рН 7,9 мени от 10 с до 2,5 мин и до достижения рН в смеси 7,8 - 8,24, после чего перемешивание прекращают и смесь отстаивают,2. Способ по и. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, 5 что процесс осуществляют при 10-30 С.1760970 10 Таблица 3 Результаты фильтрования ссаженного ванкомицина Таблица 4 Результаты фильтрования осаженного ванкомицина Составитель О. СкородумоваТехред М.Моргентал Корректор А. Ворович едактор Г, Князе роизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Заказ 3194 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5