Способ определения миграции лимфоцитов в организме

. СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ 225 ЛИН ОСУДАРСТ 8 ЕННЫЙПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ ИПРИ ГННТ СССР ИТЕТРЫТИЯМ ИЗОБРЕТЕН ПИСАНИ ВИДЕТЕЛЬСТВ К АВТОРСК(57) Изобретение относитцине и может быть испольопределения миграции лиорганизме. Цель изобретеншение точности способа.животным-реципиентам вводты меченые люминесцентнымакридиновым оранжевым и здят подсчет количества меток в исследуемом органе 199 У 02.87 05.92 рдлов Я МИГРАЦИИ кий Наливайко,инин ва01хи ржащих элемен;дами. При наИзобретени и может быть ния закономер идных: клеток цеских и Физи Цель изобр ности способа Ука занная счет того, чт Фоциты метят при 4 С в теч а регистрацию нисцентным м Изобретени ющим образом. Суспензиюицин из ц е относится к мед е использовано для у е ностей участия лв механизме пат ологицеских лроц етения - повышен Оцель достигается зао трансплантируемые ли акридиновым оранжевым ение 30 мин втемнотеклеток проводят люмиетодом.е осуществляется следу лимфоци" венно реимфоологи" ессов, ие тоц ьфаей,м,Д ципиентам, которых забивают через1,5 ц. Навеску исследуемого органаизмельчают в Физиологическом раство"ре и готовят мазки, которые просматривают под люминисцентным микроскопом, совмещенным с Фазовоконтрастнымустройством. КФ. В мазках.определяют соотношение клеток, меченных акридиновым оранжевым (АО) и светящихсяв ультрафиолете, ко всем ядросодержацим клеткам в поле зрения, причемпоследние подсчитывают в видимом свете. Затем рассчитывают процент мече"ных клеток, находящихся в органе,:от общего количества трансплантируе"мых лимфоцитов по Формуле в их лимфоц к в 1 мл) воре акри Оа) при и отмываю ез колонВ получ еток подс донор с 07 клет н в рас о (1:4 О иново- С в , проу с иной итыва 30 ми жевогЗат суспе го ора темнот пуская а ктиви взвеси ем клетнзию це м углем нных кл С 0 юрг ше(088.8)овременной биологии,с. 238-252 ют количество ядросодетов общепринятыми метоличии в суспензии 953 житов суспензию вводят вну ся к меди зовано для мфоцитов вия пОВЫфф Для этого ят лимфоци,- красителем атем провоченых кле 4 табл.17322 10 где А - измеряемый показатель8 - количество лимфоцитов, мече"ных АО, приходящихся нашесть просцитанных клеток вмазке;С - вес исследуемого органа, мг;17 " количество ядросодержащихклеток в навеске органа(,10 б).б - навеска исследуемого органа, мг;Р - количество введенных реципиенту лимфоцитов, меченых АО( 10 б);15С " общее количество клеток, подсчитанных в мазке.П р и м е р 1. Сравнивают мигра" цию интактных лимфоцитов меченых АО и Сг . Для мечения лимфоцитов Сг20 к 2-3 мл суспензии клеток добавляют ИаСг Й 1 с удельной активностью 37 10 т ;Бк/мл из расчета 1,РА 10 Бк/10 з кл/мл, инкубируют 30 мин при 37 фС, периодически встряхивая. 25 Трижды отмывают в 4-5 мл среды Хенкса без Фенолового красного. Реципиентам внутривенно вводят 1,0 мл суспензии, содержащей 5 10 - 810 жизнеспособных клеток с общей активностью около,1 10 з Бк. Радиометрию проб проводят на автоматическом счетчике И 17.-603 (ЧСР). Процент меценых клеток, находящихся в органе, от общего количества трансплантированных лим"35 Фоцитов рассчитывают по формуле 254менения содержания метки АО и Сг 1 в лимфоцитах при. культивировании п чегго при 37 С, Эти параметры оценивают после приготовления сус" пензии лимфоцитов сразу после мечения клеток АО и Сг через 1,5; 3 и 5 ч культивирования меченых клеток в среде Хенкса без Фенолового красного и эмбриональной телячьей сыворотки, Перед каждым анализом проводят двухкратное омывание клеток центриФугированием по 10 мин при 450 в с ресуспендированием в изначальном объеме питательной среды.Изучение колицества ядросодержащих элементов в суспензиях лимфоцитов, меченых АО и Сг и немеченых (контроль), не выявляет различий между сравниваемыми группами в избранные сроки наблюдения. В табл.1 приведено колицество ядросодержащих элементов в суспензиях лимфоцитов при культивировании в среде Хенкса (10 мл/л). На основании полуценных данных можно полагать, что ни АО, ни Сгпри заданных условиях экспери" мента не вызывают структурного разрушения лимфоцитов и не отличаются по этому критерию друг от друга, Отме чаемое во всех трех сериях эксперимента уменьшение количества ядросодержащих элементов обусловлено неспецифическими причинами и связано с условиями культивирования и манипулирования с суспензиями и является характерным для моделей п чг.го, А = - ф 100 ЖВС фгде А " процент меченых Сг лимфоЯцитов в органе от общего ко;лицества введенных лимфоцитов;8 - радиоактивность исследуемо"го органа;С - общая радиоактивность вве.5денной суспензии меченых Сглимфоцитов,.Сравнивают миграцию интактных лимфоцитов, меченых АО и Сг в7 костный мозг одной бедренной кости, .печень, почки, селезенку, подчелюстиые слюнные железы через 1,5 ц пос" ле внутривенной трансплантации интактным реципиентам. Кроме того, про. Водят сравнение количества ядросодержащих элементов описанным мето" дом, количества жизнеспособных клерк по тесту стрипановыи синим, из В табл.2 показана жизнеспособность лимфоцитов по тесту с трипоновым синим при культивировании в среде Хенкса (3),40 Исследование жизнеспособности 5 меченых клеток выявляет снижение этого показателя во всех сериях экспери"мента, что также связано с условиями культивирования лимфоцитов, Однакопри этом наибольшее количество не,жизнеспособных лимфоидных клеток вовсе сроки наблюдения выявляется примечении их Сг" . Метка,АО не приводит к увеличению процента нежизнеспособности клеток в сравнении с контролем. Таким образом мечение лимфоцитов Сг сопровождается нарушениемих жизнеспособности, в то время какмецение их АО подобного эффекта невызывает.5 1В табл.3 показано изменение содержания метки в лимфоцитах при культивировании в среде бенкса,Если при мечении лимфоцитов АОметка присутствует во всех клеткахво все сроки наблюдения, то при мечении их Сг отмечается достоверное51снижение радиоактивности проб, начиная с 1,5 ч культивирования, Снижение радиоактивности связано не только со снижением числа лимфоцитов впробах, но и со спонтанной потерейСг клетками в динамике культивирог 6вания, так как пересчет радиоактивности проб на 10клеток суспензииг.также показал ее достоверное падение,Сравнение результатов распределения в организме реципиентов трансплантированных лимфоцитов, меченыхАО и Сг, дает результаты, приведенные в табл.4. Если общий характерраспределения меченых АО лимфоцитовсущественно не отличается от данныхпрототипа то доля меченых АО лимфоцитов, мигрировавших в органы, вовсех случаях ниже, чем при их меткеСг . Анализ экспериментальных данЙных позволяет считать, что в данномслучае применение способа прототипаприводит к завышению реального количества мигрировавших в орган лимфо.цитов. Подобное завышение, приводя"щее к ошибке в исследовании, связано как с частичной утерей метки отдельными клетками, так и с утратойопределенным количеством лимфоцитовжизнеспособности, выявленными ранее.Это приводит к усилению реутилизации Сг клетками реципиента и неспеЯцифическому распределению метки ворганизме. Метка задерживается в органах с богатым кровоснабжением ибольшим числом клеток, способных вФагоцитазу. Причем показано, чтопреимущественно Сг задерживаетсяв печени за счет поглощения его мак" формула изобретения35 Способ определения миграции лимфо"цитов в организме. путем мечения лимФоцитов, их трансплантации.в организмс последующим выявлением метки в ор ганах, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью повышения точности и уп"рощения способа, в качестве меткииспользуют краситель акридиновыйоранжевый, мечение лимфоцитов прово дят в течение 30 мин при 4 С в темно"те, а выявление метки проводят по еелюминисценции. 732225 6рофагами. Последнее подтверждаетсяполученными данными (см,табл,1), свидетельствующими о том, что повышениев суспензии доли нежизнеспособныхлимфоцитов, меченых ЯО, путем их нагревания, приближает результаты, полученные предлагаемым способом кданным прототипа,10 Из этого следует, что косвенныйподсчет распределения трансплантированных лимфоцитов у реципиентов порадиоактивности органов менее точениз-за существенного неспецифическо 15 го распределения метки в организме.В предлагаемом способе лечение лимфо"цитов АО не сопровождается утерей мет"ки и снижением жизнеспособности меченых лимфоцитов. Кроме того, при использовании предлагаемого способа в органе учитываются меченые клетки, ане количество метки, как в прототи"пе.Таким образом, данные сопоставительного анализа, полученные по результатам выполнения предлагаемогои известного способов, подтверждаютповышение точности способа. Крометого, предлагаемый способ позволяет 30 значительно упростить и снизить стоимость его выполнения, он более эффективен.1732225 Т а б л и ц а 1 Контроль Лимфоциты, Лимфоциты, (без мечения) меченые АО меченые.Сг Время исследования После приготовлениясуспензии лимфоциеетов 13,4 0,42 13,210,47 11,710,62 12,010,45 13,1+0,45 11,7 10,42 Сразу после метки Через 1,5 ч послеметки 11,5 Ф 0,62 11,310, 09 10,110,74 Через 4 ч послеметки 10,7 ф 0,45 9,810,48 10,10,50 Через 5 ч послеметки 9, 710,45 9,810,40 9,210,43 П р и м е ч а н и е. Число проб и = 10 во всех случаях. Табли ца 2ее е е щ ЛимФоциты,меченые ггЯВремя исследования Лимфоциты, меченые АО Контроль без меченияПосле приготовлениясуспензии лимфоцитов 97,6+0,30 97,310,52 97,610,55 96,8+0,45 97,9 Ф 0,20 95,5+0,25 Сразу после метки Через 1,5 ч послеметки Через 3 ч послеметки 76,9 ф 2,01 66,711,12 ф Через 5 ч послеметки Достоверность различий между опытными группами Р(0,05,Достоверность различий с контролем Рс0,05,Таблица 3 Радиоактивность проб лимфоцитов, меченых СгЯ Время исследованияЮ е е е10 З Бк/10 кл Процент от6 10 Бк Процентот исисходногоуровня ходногоуровня Сразу после метки лимфо 100 4,ООФ,О,15 0,30310, 011 100 100 цитов Через 1,5 чпосле метки 100 3,24 Ф 0,19 Через 3 ч после мет ки100 2,63+0,09 65,812,15 0,262+0,009 86,5+2,87 Процент меченых АО лим- Фоцитов 90, 3+1, 02 М,141 43 79,51,33 88,741,52 83,31,1080,1 11,13+ 75,5 10,98+ 81,04.2,88 0,27010,010 89,1 Ф 3,1410 Продолжение табл. 1732225 Радиоактивность проб лимфоцитов, меченых Сг Время иссле" дования 10 з бк/10 кл 10 з Процентот исходногоуровня Через 5 чпосле метки 100 2,3010,10 . 57,5+2,40 0,25 Ф 0,010 83,1 Ф 3,54в+Достоверность отличий с исходным уровнем Р( 0,05 Таблица 4 аЬДанные известного способа Собственные данные Орган 8,3 9,010,41 Кровь Костныймозг 3,240,39 2,5010,31 19 р 4 ф 1,63 Зэ 2110157 1,5+0,23 0,71 Юе 201,2 т 0,20 7 ф 5 Иф 09 19,0 19,7 11,0-13,0 2,01,215,3 20 1,0 Лимфатичес"кие узлы 0,014 0,1-0 3 1,И 0,20 0910,09 0,75 Ц,15 Метка лимфоцитов Сгф.ф" Метка лимфоцитов АО,Редактор А. Мотыль Составитель С, РыбалкинТехред М,дидык Корректор И. Самборская Заказ 1577 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-.35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,303 Печень ПочкаСелезенка Подчелюстные слюнные желе- зы Процент меченых АО лим- Фоцитов Ра спределение лимфоцитов в соответствии в объемом кровотока в орга- не Введение лимфоци" тов, убитых наг" реванием Введениежизнеспособныхлимфоцитов" Введениежизнеспо"собныхлимфоцитов" 4,00,2718,342,711,310,2614,911,11 Введение лимфоци-тов, убитых нагреваниемф+ Процент отисходногоуровня Введениежизнеспособныхлимфоци"товв+