Способ получения панкреатина из поджелудочной железы

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИН 51)5 А 61 К 35 ЕНИЯ и Н ПАТЕН иииГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР АНИЕ ИЭОБ(54) СПОССьБ ПОЛУЧЕНИЯ ПАНКРЕАТИНА ИЗПОД)КЕЛУДОЧНОИ )КЕЛЕЗЫ(57) Изобретение относится к медицине, в частности к способу получения лекарственных средств, Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта с более высокой активностью. Для этого замороженные свиные поджелудочные железы размельчают, пропуская через мясорубку, и проводят аутоизобретение относится к медицине, в частности к способам получения лекарственных средств.Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта с более высокой активностью.П р и м е р 1. 100 кг замороженных при низкой температуре свиных поджелудочныхжелез, пропуценнььх через волк"машину или через мясорубку, переменивают в 250-литровом реак.торе с раствором 100 г глюконата кальция в 20 л воды совместно с 200 г силиконового препарата, препятствующего пенообразованию. В зависимостиот содержания свободного трипсина 2лиэ при температуре (-2)-(+30) С и рН 65-8,5. Параллельно через каждые 15 мин анализируют пробу на осаждение в 55-65 Е-ььом водноьь изопропиловом спирте. При наличии скорости осаждения аутолпза 3-10 ммв течение 1-3 мин прекращают аутолиз путем добавления иэопропилового спирта до конечной концентрации 30-352, затем проводят Фильтрование через сито, В полученный раствор добавляют изопропиловый спирт в конечной концентрации 55-657. при 20-240 С, Полученный осадок промывают изопропиловым спиртом концентрацией 75-953. Суспензию фильтруют на нуч-Фильтре диаметром 40 см и отсасывают для просушивания в вакууме при 55 С и давлении 5 мбар. Способ позволяет повысить выход целевого продукта с более высокой ак" тивностью. 4 табл. в железах добавляют в качестве средства, способствующего началу процесса, до 1 кг готового панкреатина,растворенного в 5 л воды. Зто коли ство панкреатина устанавливают посредством "37 пробы на гидролиз".С этой целью отбирают из загруженной партии 120 г исходного материала,После добавления 15 л 847.-ного изопропилового спирта замешивают раствор 1,3 кг бикарбоната натрия в 20 л воды. ььставляют стоять на ночь причем температура возрастает пример,но от 2 до 12 С, на следующее утро подогревают до 20 С и продолжают переомешивание при этой температуре.Момент окончания аутолиэа распознают пробой на осаждение. С этой цельюво время последнего периода аутолизасначала каждые полчаса, затем черезкаждые 15 мин отбирают 10 г суспензия,перемешивают 1 мин с 5,4 мл 84 -ногоизопропилового спирта с помощью стеклянной палочки, образовавшийся раствор отделяют от волокон, приставшихк стеклянной палочке и замешивают в20 мл содержащегося в стакане на50 мл, снабженном магнитной мешалкой,843-ного водного раствора изопропилового спирта, Через минуту останавливают мешалку и оставляют для осаждения примерно 3 мин,Если проба положительна, аутолиз(наличие более или менее прозрачногослоя высотой 3 мм через 1 мин или 2010 мм через 3 мин) заканчивают,В качестве примера воспроизводится.характерная серия испытаний на осажде"ние, которые применяли, как толькотемпература автолизата достигала 25Данные испытания на осаждение приведены в табл. 1.Из этого примера видно, что наиболее благоприятный момент временидля окончания аутолиза наступает через 3 ч. Для того, чтобы получитьвозможность достижения сравнимых соотношений при применении неизвестных(например, сохранявшихся более короткое или более продолжительное время)препаратов свиных поджелудочных желез, проводится "37 проба на гидролиз".Из кащицеобразной массы желез, смешанных с глюконатом кальция, 10отбирают 120 г, смешивают с 1,5 гбикарбоната натрия в 25 мл воды и перемешивают 30 мин при 37 С. С пробойэтого ускоренного аутолизата проводятиспытание на осаждение. К основноймассе загруженного материала добавляют свободный трипсин (в Форме панкреатина) в следующих количествах: менеечем при 2 мм/3 мин - 2 млн. Е, призначении до 12 мм/1 мин - 1 мчн. Еа при еще большей скорости осаждениясвободный трипсин не добавляют (1 млн.единиц свободного трипсина содержися, например, в 250 г поджелудочнойжелезы с 4000 единицами в 1 г). Таким .путем возможно стандартизировать дляпрактических производственных условий сырьевой исходный материал различного происхождения, 93,6 После определения наиболее благоприятного момента времени аутолиз загруженной партии заканчивают посредством подачи насосом 72,5 л 847,-ного(регенерированного) изопропиловогоспирта. Перемешивают 1/2 ч, причемобразуется прозрачный раствор, содержащий нерастворимые волокна, которыеотделяют отсеиванием. Для этого содержимое реактора спускают в открытьгйкотел на 50 л с заложенным ситом,имеющим ячейки около 5 мм. Котел снабжен якорной мешалкой. Сточный патрубок котла, снабженного ситом, соединяют посредством насоса с 500-литро"вой емкостью из полипропилена. В этуемкость загружают 318 л 842-ногоизопропилового спирта, туда же теперьдобавляют примедленном перемешиванииспускаемый раствор, пропущенный через сито. Волокна, оставшиеся в котле иа сите, перемешивают еще 10 мин,причем волокна становятся относительно сухими. Вес волокон составляет 78 кг,В 500-литровый резервуар помещаютпанкреатин в виде грубого осадка втечение 1 ч на объем 80 л (при 20 С;при 24 С в течение 1/2 ч. Отстоявшуюся жидкость спускают сифоном и направляют для регенерации на перегонку,Массу, оставшуюся на днище, перемешивают с 63 л регенерированного 84 Х-ного изопропилового спирта и оставляютеще на ночь для дополнительного осаждения. На следующий день этот процессповторяют, смешивают полученный такимпутем осадок на днище примерно с 45 л84%-ного изопропилового спирта, т.е.с настолько большим количеством, чемнеобходимо для приготовления суспензии панкреатина в 847.-ном изопропиловом спирте. Эту суспензию фильтруютна нуч"Фильтре диаметром 40 см и отсасывают до хорошего просушивания.Плотную массу, отжатую на фильтре,быстро измельчают на резательной машине и распределяют на металлическомлисте. Высушивают всю ночь при температуре обогрева до 55 С при вакуумедприблизительно 5 мбар.Выход панкреатина, кг 11,6Активность амилазы,РхРЕ/мгАктивность липазы,РхР =Е/мг 90,3Активность протеазы,РхР=Е/мг:, активированногоэнтерокиназойбеэ активированияСодержание сухого вещества, ЕСодержание жира, 7Плотность насыпная, г/млПлотность, г/млЧисло микроорганизмов,на 1 г 200Нежелательные микроорганизмы поФармакописи СНА 17-го издания (ББРХУЛ) отсутствуют.П р и м е р ы 2 - 4. Поступают 25аналогично примеру 1, изменяя условияпроведения способа (рН, содержаниеизопропанола, температуру при аутолизе или содержание изопропанола припрерывании или температуру и содержание изонропанола при осаждении/промывании). Разницы в выходе по панкреазину не наблюдается, если испытание наосаждение варьировать в каждом случаевпределахдиапазона от 3 до 10 мм/мин.Эти условия были испытаны для каждогопримера в отдельности,Результаты испытаний приведены втабл. 2. В40П р и м е р 5, Поступают аналогично примеру 1, но без добавки изопропанола. Конца аутолкза достигают через 2,5 чАктивность амилазы 83 Хпри нагрузочной потере 5 Х и активность липазы 80 Х при нагрузочкой потере 15 Г,П р и м е р 6. Поступают аналогично примеру 1, добавляя 5 л пропанола,Конца аутолиза при этом достигают через 2,75 ч. Активность амилаэы 88 Хпри нагрузочной потере около 57; алипаэы 88 Х при нагрузочкой потере 103.П р и м е р 7. Поступают аналогично примеру 1, но добавляют 10 л изопропанола. Конца аутолиэа достигаютчерез 3 ч. Активность амилазы 933(нагрузочная потеря ЯХ). 6П р н м е р 8. Если поступить аналогично примеру 1 и повысить температуру до 25 С, а потом прервать реакоцию, то достигнутые результаты будутте же, что и при температуре 15 С,П р и м е р и 9. - 12, Аутолиз иосаждение смеси энэимов иэ водногоаутолиэата осуществляют, как описанов примере 1. Чтобы определить влияниеконцентрации иэопропилового спирта напроцесс промывания, к пробам суспенэии панкреатина добавляют изопропиловый спирт разной концентрации. Применяют по 1 л осадка, полученного в результате сливания сиФоном отстоявшегося верхнего слоя жидкости., 1 лосадка соответствует количеству приблизительно 200 г сухого панкреатина.К каждой пробе добавляют по 1 л изопропилового спирта. Разные концент"рации получают в результате разбавления абсолютного иэопронилового спирта. Плотный Аильтровальный осадок,полученный, как описано в примере 1в результате двухкратного промыванияи отсасывания на нутче, подвергаютвысушиванию, как описано в примере 1,после чего определяют его активностьи насыпной вес. При применении только653-ного изопропилового спирта наблюдается небольшое уменьшение активности. Несмотря на это качество полученного в результате продукта выше, чемкачество известных продуктов. Насып"ной вес продукта уменьшается с увеличением концентрации изопропиловогоспирта,Результаты приведены в табл. 3.Ланные сравнения стабильности ами"лазы и липазы у панкреатииа, приготовленного по известному и предлагаемому способам, представлены втабл. 4.Табл. 4 показывает, что у панкреатина, полученного известными .способами, потеря при нагрузке сильно возрастает по мере увеличения активности.Что касается панкреатина, изготовленного-по предложенному способу, то несмотря на существенно высокую знзим .ную активность, он отличается при нагрузке наименьшей потерей. Формула и з обр ет ения Способ получения панкреатина изподжелудочной железы путем проведенияаутолиза при комнатной температуре,1644712,перемешивания с органическим растворителемм, удаления осадка Фильтрацией, промывания его органическим растворителем и высушивания, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышеизопропиловым спиртом, а высушнваниепроводят в среде азота при давлении5 мбар. Та бли ца ния выхода целевого продукта,с болеевысокой активностью, аутолиз проводятв реакторе при рН 6,5-8,5 и температуре (-2)-(+30) С, при этом одновременно анализируют пробу, взятую из.реактора, на осаждение в,55-653-номводном изопропиловом спирте и, кактолько в пробе достигается скорость Продолжительность .аутолизапри 20 С,Значение аутолиза мм/0,5 мин мм//3 мин мм/1 мин 1,00 осаждения выпавшего в осадок аутоли 200 эата 3-10 мм в течение 1-3 мин, пре" 2,50 кращают аутолиз в реакторе путем до,75 баапения изопропилеового спирта до ко,00 нечной концентрации 30-353, затем по25 сле Фильтрации в полученный раствор 203,50 вновь добавляют изопропиловый спирт 3,75 до концентрации 55-65 Ж при 20-24 С, 4,00 полученный осадок промывают 75-953-ным Та бли ца 2 саждение ПромываниеАутолиз Пример рН пытае,1644712 Та блица 4 Способ Амилаза Липаза Исходная акИсход- Потеряная ак- при нативность, грузке, ЕГьР-.Е/мг тивность,ГьР-Е/мг Известный Предлагаемый 93,6 90,3 Составитель Л.КонниоваТехред М.Дидык . Корректор О.ципле Редактор 0.13 рковецкая/Заказ 1249 Тираж 460 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г,ужгород, ул. Гагарина,103 43,1 57,2 51,0 6 43 41