Способ определения азотсодержащих лекарственных веществ основного характера в ткани печени

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 19) (И ц 4 С 0111 3.Е 363 НЯС.;1 й 1 ы;,ЫО ,Б 11:1 Я, ЕА САНИЕ ИЭОБРЕТ СКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(54) СПОСОБ О ЩИХ ЛЕКАРСТВЕ ХАРАКТЕРА В Т (57) Изобрете ции, а именно рственньп меди- Ленинского комческому анали А,Кна оде ржащовногозобретеоба. Сутом, ч л арак ия яиост ие процесс ых соединенийриала - Автотепени канд. вия экстр ань н споль одержащих ле овного харак якой, серной,и органическиеол, ацетонитри ию и последующ деление провод ксуснои,бретен ислот: со авелевой, ели - эта фармации,ическому тноситс аствор ацетон. е количест т по слеотсодерв основн Экстраенное оп дующеи методике.К 5,0 г ткани печени, измельченной на мясорубке, добавляют 0,5 мл 0,1 Х-ного водного раствора нейтрального красного, тщательно перемешивают и оставляют на 2 ч (прн большей экспозиции наблюдалось разложение нейтрального красного, что доказывалось методом тонкослойной хроматографии), Затем к печени добавляют 5,0 мл соответствующего экстрагента и экстрагируют на аппарате для встряхивания в течение 1 О мин, центрифугируют 5 мин при 2,5 тыс. об/мин, Экстракты сливают во флаконы, операцию ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР 1(71) Алтайский госудацинский институт им,сомола(56) Титова А.В. Изучэкстракции лекарствениз биологического матреф. на соиск, учен.фарм. наук, М., 1984,точнее к химико-токсикол ализу для определения ащих лекарственных вещ о характера в ткани печек Цель изобретения - упрощение способа при сохранении точности,Сущность изобретения заключаетсяв том, что в отличие от известногоспособа определения лекарственныхвеществ в биологическом материале,согласно изобретению перед экстракцией вводят в ткань печени нейтральный красный (НК), выявляют оптимальные условия его экстракции и очисткии используют их для определения азотсодержащих лекарственных веществ основного характера.П р и м е р 1, В качестве экстрагентов используют водные растворы РЕДЕЛЕНИЯ АЗОТСОДЕРЖА НЬК ВЕЩЕСТВ ОСНОВНОГО КАНИ ПЕЧЕНИие относится к фармак хмко-токсколо гу для определения азотарственных веществ осера в печени. Целью яется упрощение споизобретения состоитвляют оптимальные усции и очистки введеннотрального красного и для определения азотарственных веществ ос ера 5 табл3 150815 экстракции и центрифугирования повторяют еще 3 раза, сливая экстракты в новые флаконы. Параллельно получают экстракты из печени, не содержащей НК, к которым после экстракции добавляют 0,1 мл 0,17.-ного раствора нейтрального красного (стандартные пробы). Кроме того, анализируют холостые пробы, Все экстракты подщелачивают 507.-ным раствором едкого натра до рН 10-11, добавляют 5,0 мл воды, 10,0 мл хлороформа, встряхивают и центрифугируют как описано выше. Органические фазы отделяют, фильтруют через небольшие бумажные фильтры, отбрасывая первые порции фильтрата, Оптические плотности измеряют с помощью спектрофотометра СФв кюветах 1 см при длине волны 525 нм относительно хлороформа. 20 Затем к раствору в кювете добавляют 1 каплю насыщенного раствора трихлоруксусной кислоты в хлороформе, перемешивают и вновь измеряют оптическую плотность при той же длине волны. 25 Разность (ДД) между оптическими плотностями прямо пропорциональна концентрации НК, закон Бугера соблюдается в интервале концентрации 1,5-15 мкг/мл. Примеси из ткани печени (в холостых 30 пробах) влияния на количественное определение не оказывали, те. не дают изменения оптической плотности в описанных условиях. Расчет количественного содержания НК в процентах прово дят по формуле. ьДисс 01 100 р)Ь Дд 095где ЬДи АДя - разность между 40 оптическими плотностями растворов исследуемых и стандартных проб соответственно.Результаты экспериментов приведены в табл. 1. 45 Из табл. 1 видно, что перспективными экстрагентами являются этанол, ацетонитрил, ацетон. Из них как наиболее доступный и дешевый выбран ацетон. При использовании в качестве экстрагента ацетона извлечения, полученные на 1-й ступени экстракции, содержали меньше соэкстрактивных веществ, чем на последующих трех (по ультрафиолетовым спектрам абсорбции нулевьк проб, по образованию эмульсии при экстрагировании хлороформом). Содержание воды в ткани печени людей бколеблется в пределах б 0-757, т.е.в 5,0 г печени содержится около 33,7 мл воды, В процессе экстракцииацетон смешивается с водой (в соотношении приблизительно 5:3). Использование на 2, 3, 4-й ступенях экстракции вместо ацетона смеси ацетонас водой в соотношении 5:3 не влиялона выход НК и и то же время уменьшило количество примесей, поэтому вкачестве оптимального экстрагента на1-й ступени экстракции используютацетон, на 2, 3, 4-й - смесь ацетонаи воды в соотношении 5;3,П р и м е р 2, Выбор степениизмельчения ткани печени. Для проверки влияния измельчения ткани печени на выход НК были поставленыопыты на экспериментальных животных(собаках) по следующей методике, Собаке весом 10 кг через зонд вводят0,5 г нейтрального красного в видеводного раствора, Через 1,5 ч животное умертвляют с помощью электрического тока, Часть печени измельчаютс помощью гомогенизатора (РТ-У 4-28000 об/мин), часть - с помощью мясорубки, имеющей решетки с различнымдиаметром отверстия: 4,5 мм (Рд);7,5 мм (Р), 0,5 мм (Р 4) 13 мм(Р), а также берут для анализацельные кусочки печени размером1 14,5 см (Рь)Затем к 5,0 г ткани печени различной степени измельченности добавляют по 5,0 мл ацетонаи получают экстракты по описаннойметодике.Результаты эксперимента представлены в табл, 2,Дисперсионный анализ результатов, представленных в табл. 2 показал, что различия между оптическими плотностями при различной степени измельчения значимы (по критерию Фишера), а в случае исследования цельных кусочков (Р) результаты существенно ниже остальных. При сравнении оптических плотностей растворов, полученных при исследовании печени со степенью из мельчения Р -Р значимых различий нет (по критерию Дункана). За опти" мальную степень измельчения ткани печени принимают измельчение с помощью мясорубки с диаметром отверстий решетки 4,5 мм.П р и м е р 3. Выбор продолжительности экстракции., Собаке весом5 1508110 кг через зонд вводят в желудок0,5 г НК в виде водного раствора,Через 1,5 ч собаку умертвляют, Пецепь измельчают с помощью мясорубкии экстрагируют в течение разноговремени (1 О, 35 и 60 мнн) по описанной методике.Результаты эксперимента представлены в табл. 3, 10Данные табл. 3 показывают, чтоувеличение продолжительности экстрак -ции от 10 до 60 мин влияния на выходНК из ткани печени не имеет, Продолжительность экстракции О мин оптиманьи а,П р и м е р 4. Выбор оптчмальныхусловий очистки, Отделение ацетонаот воды с одновременной экстракциейНК в ацетонДля этой цели применяют 20безводный карбонат калия, при добавлении которого в избытке к ацетоноводному экстракту и встряхивании про- .исходит разделение ацетона и воды(высаливание ацетона) и гомофазная 25экстракция НК в ацетоновый слой, Выход НК в процентах, определенный поописанной методике, составил 97%.П р и м е р 5, Выбор условий реэкстракции нейтрального красного в 30соляную кислоту,К ацетону добавляют смесь эфира игексана, Для выбора оптимальных условий на этой стадии применяют планирование эксперимента методом крутоговосхождения. В качестве факторов рассматривают: Х 1 - объем смеси эфиргексан, мл; Х - процентное содержание эфира в смеси эфир - гексан; Х -объем 0,5 н.раствора соляной кислоты, 0Критерием оптимизации (У) являетсявыход нейтрального красного в процен -тах, который определяют по следующейметодике, К высаленному ацетону добавляют определенные количества смесиэфир - гексан и 0,5 н,раствора соляной кислоты, Встряхивают и центрифугируют в течение 5 мин при 2,5 тыс.об/мин, Водную фазу отделяют и измеряют оптическую плотность при длиневолны 525 нм, Расчет процентного выхода НК проводят по стандарту, добавляют 0,1 мл 0,1%-ного раствора НК ксоляно-кислому реэкстракту. Послереализации полного факторного экспериметра (см, табл. 4) оптимальными 56 6оказались следующие условия; объем смеси эфир - гексан (в расчете на 10,0 мл ацетона) 15,0 мл; соотношение эфир - гексан в смеси 1:1; объем 0,5 н. раствора соляной кислоты 1,5 мл. Для более полной реэкстракции НК операцию повторяют дважды.П р и м е р 6Выбор условий эк- стракции НК в органический раствори- тель, Подщелачивание соляно-кислого реэкстракта до рН 10-11 50%-ным раствором гидроксида натрия, насыщение кристаллическим хлоридом натрия и последующая экстракция 10,0 мл эфира обеспечивают выход НК, равный 95-97%.Таким образом, выход НК на этапах экстракции из ткани печени и последующей очистки составил в среднем 80%.П р и м е р 7. Использование выявленных оптимальных условий экстракцни и очистки для определения азотсодержащих лекарственных веществ основного характера в ткани печени.Лекарственные вещества основногохарактера (имизин, но-шпа, верапамип)экстрагируют и очищают в условиях,выявленных для НК по описанной методике, Количественное определение проводят после испарения эфира и растворения остатксв в спирте. Оптические плотности растворов определяют с помощью спектрофотометраСФв кювете 1 см при длинахволн соответственно для имизина, но-шпы, верапамила при 254, 360и 228 нм, При количественном определении учитывают фоновое поглощениепримесей, Выход имизина, но-шпы и верапамила (см. табл, 5) коррелируетс выходом НК,Формула изобретенияСпособ определения азотсодержащих лекарственных веществ основного характера в ткани печени, включающий их экстракцию и последующую очистку, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа при сохранении точности, экстракцию и очистку проводят в условиях, аналогичных экстракции и очистке введенного в ткань нейтрального красного.1508156 Т а б л и ц а 1Выход нейтрального красного в,процентах по ступеням экстракциии в сумме По ступеням экстр акции Растворитель Тто 1 тп 1 гг 0,1 н.раствор сернойкислоты0,1 н, раствор солянойкислоты10 Е-ный раствор уксуснойкислоты107.-ный раствор щавелевойкислотыЭтанолАцетонитрилАцетон 4 3 2 3,. б+ 2, О 4,3 28,9 3,0 12,4 62.,2+10,4 10,4 9,212,49911,7 38,3 М,4864 к 4,686,2 ф 3,2,947 ф 6,2 7,9 б,б 4,7 6,5 11,9 44,7 44 р 9 51 р 2 Т капица 2 Экстракцпя нейтрального красного из ткани печени разной степени измельчения (приведены значения в единицах оптической плотности хлороформно-ацетоновых экстрактов) Степеньизиельче з ния Х+ х 2,3660043 2,275 з 0,071 2,319 0,027 2,346+0,119 ,3010,101 0,916+0,22 Таблица 3 окстракция нейтрального красного в течение равного времени (в единицах оптической плотности хлороформно-ацетановых экстрактов) Продолжительно стьэкстракции, мии Х -Ах 1,060 ф 0,026 1,0850,100 1,0610.,0571508156 10 Таблица 4 План Факторного эксперимента иа стадии реэкстракции нейтрального красного в 0,5 н.раствор соляной кислоты Факторы Опыт, У У Объем 0,5 н. раствора соляной кислоЭфир всмеси, 3 Объем смеси эфир-гексанмл Таблица 5Определение имизина, но-шпы,верапамила в ткани печени Лекарственные веществаИмиэинНо-шпаВер апамил Со ст ави тел ь А, СкуратТехред М,Иоргентал Корректор А.Обручар Редактор И. КелемешЗаказ 5536/48 Тираж 789 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5