Способ определения формиат-иона в водных растворах

сится к льзован ожных б оло гиия -зобретеьности упроще испольлюче енармиатдр РР ЮРУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(71) МГУ им. М. В, Ломоноси Институт биохимии им, А,(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕЬ ВОДНЫХ РАСТВОРАХ(57) Изобретение отнмии, может быть испанализа формиата в слческих смесях, Цельувеличение чувствителние способа путем исзования растворов фо 0 4 С 12 И 11/14 С 12 Ц 1/ зы с различной активностью, заменойих НАД (никотинамидадениндинуклеотид)-зависимой формиатдегидрогеназой, иммобилиэованной на нерастворимом неорганическом носителе, Для этого исследуемый раствор, содержащийформиат-ионы: НАД ( вмМ) и стабилизатор активности формиатдегидрогеназы со скоростью 0,5-5,0 мл/мин через проточный реактор с вытеснением,заполненный иммобилизованной на неорганическом растворителе НАД-зависимой формиатде гидро геназой с суммарной активностью 0,075-2,2 мкмоль/мин. Объем образца в 1,5-8 раз превьппает объем реактора, На выходе из реактора регистрируют величину максимальной оптической плотности образующегося НАД и по калибровочному графику определяют концентрацию формиата. 1 ил.Изобретение относится к областибиохимии и может быть использованодля анализа формиата в сложных биологических смесях,Цель изобретения - увеличение 5чувствительности и упрощение способа эа счет устранения необходимостииспользования растворов формиатдегидрогеназы с различной активностью,путем их замены НАД-зависимой формиат Одегидрогеназой, иммобилизованной нанерастворимом неорганическом носителе.На чертеже изображены калибровочные кривые для определения формиата при степенях конверсии субстрата5 Ж (1) и 157 (2 и 3) (кривая 1реактор 0,2 мл, активность формиатдегидрогеназы 0,080 мкмоль/мин, скорость прокачивания образца 0,5 мп/мин, 20объем образца 0,5 мл; кривая 2 - реактор 0,8 мл, активность фермен:та2,2 мкмоль/мин, скорость подачираствора 5 мл/мин, объем образца1,2 мп; кривая 3 - реактор 0,6 мл,активность фермента 1,1 мкмоль/мин,скорость прокачивания 2,5 мл/мин,объем образца 0,9 мл; концентрацияНАД во всех экспериментах 1,25 мМ,0,05 М фосфатный буфер, рН 7,0, 3020 ОС) .Способ осуществляется следующимобразом,Исследуемый раствор, содержащийформиат-ионы, НАД (1-10 мМ) и стабилизатор активности формиатдегидрогеназы, пропускают со скоростью 0,55,0 мл/мин через проточный реактор свытеснением, заполненный НАД-зависимой форми ьтдегидрогеназой иммобилизованной на нерастворимом неорганическом растворителе с суммарнойактивностью 0,075-2,2 мкмоль/мин,так, чтобы степень превращения субстрата составила 5-157Для этого 4объем образца в .1,5-8 раз превышаетобъем реактора. На выходе из реактора регистрируют величину максимальной оптической плотности образующегося НАД и по калибровочному графику определяют концентрацию формиата,П р и м е р 1, Проточной реактор с вытеснением объемом 0,2 мл содержит 80 мг иммобилизованной на аминированном силохроме или стекле формиатдегидрогеназы с суммарной активностью 0,075 мкмоль/мин при рН 7,0 и 20 С. К 0,3 мл раствора формиата натрия (1,5 объема реактора) в 0,05 Мфосфатном буфере (рН 7,0) добавляют 25 мкл 25 мМ раствора НАД и пропускают через реактор со скоростью0,5 мл/мин при 20 С. Оптическую плот.ность раствора на выходе из реактора измеряют при 340 нм в проточнойкювете, Минимально определяемая концентрация формиата составляет 1,5-510 М, Зависимость оптической плотности от концентрации формиата представлена на чертеже (кривая 1),П р и м е р 2, Выполняют способ,как в примере 1, эа исключением того, что активность фермента составляет 2,2 мкмоль/мин, скорость подачи раствора 5,0 мл/мин, соотношениеобъемов образца и реактора 8:1 (4,8и 0,6 мл соответственно). Зависимость оптической плотности от концентрации формиата представлена начертеже (кривая 2), Минимально определяемая концентрация формиата равна 5 10 М,П р и м е р 3. Способ выполняют, как в примере 1, Объем реактора 0,6 мл активность фермента1,1 мкмоль/мин, объем образца 1,2 мл(соотношение 2:1), скорость подачи раствора в реактор 2,5 мл/мин,Данные представлены на чертеже (кривая 3). Минимально определяемая концентрация формиата 5.10М,Формула изобретенияСпособ определения формиат-иона в водных растворах путем ферментативного восстановления никотинамидадениндинуклеотида при помощи,НАД- зависимой формиатдегидрогеназы с последующей регистрацией содержания восстановленного никотинамидадениндинуклеоТида, о т л и ч а ю щ и й - с я тем, что, с целью увеличения чувствительности и упрощения способа за счет устранения необходимости использования растворов формиатдегидрагеназы с различной активностью, анализируемый образец пропускают со скоростью 0,5-5,0 мл/мин через проточный реактор с вытеснением, заполненный иммобилизованной на нерастворимом неорганическом носителе НАД-зависимой формиатдегидрогеназой при активности фермента 0,075- 2,2 мкмоль/мин и соотношении объемов образца и реактора (1,5-8):1,