Питательная среда для выявления сальмонелл

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК С 12 О 1/ 5 РЕТЕНИЯ 3 Бюл. М 32 роизводств батывающе ное объедпромышл нение ности техни 1 й. М,; ния, ьмоод об и свй АТЕЛЬНАЯ СРЛЬМОНЕЛЛ ЕГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(21) 4906021 (22) 17.12.90 (46) 30,08.92 (71) Научноптицеперер "Комплекс" (72) С,С. Коз (56) Лабинс кой микроб Медицина,СТ, СЭ Метод опре нелла; М., иЗагаевс наружения нине. - Мяс с, 34.(54) ПИТ НИЯ СА ак и А.А. Гусевая А,С, Микробиология сиологических исследован978, с. 363,В 52,09-85, Продукты питаделения бактерий рода салз-во стандартов, 1985,кий И.С. Ускоренный метмикрофлоры в говядиненая индустрия СССР, 1984, ЬЕДА ДЛЯ ВЫЯВЛ Изобретение относится к микробиологии, а именно к плотным дифференциальнодиагностическим средам, используемымдля выделения сальмонелл,.Существующие дифференциально-диагностические среды обладают недостаточными селективными свойствами поотношению к сальмонеллам. Имеющиеся впрактике среды дают неплохйе результатыпри работе с чйстыми культурами, В процессе работы при выделении сальмонелл, какправило, приходится работать со смешанными культурами. При росте различных микроорганизмов на этих средах (Эндо,Левина, Плоскирева) культуры трудно дифференцируются,1758 О 76 А 1(57) Область применения: микробиология, плотная дифференциально-диагностическая среда, выделение сальмонелл, Среда содержит дистиллированную воду, лактозу, калий,фосфорйо-кислый двузамещенный, стерильную желчь крупного рогатого скота, питательн ый ага р, сахарозу, трифенилтетразолиум хлористый и малахитовый зеленый при следующем соотношении ингредиентов, мас. %; питательный агар 3,9 - 4,5; калий фосфорно-кислый двузамещенный 0,25- 0,35; лактоза 1;00 - 2,0; сахароза 1,00 - 2,0; стерильную желчь крупного рогатого скота 5,0 - 15,0; малахитовый зеленый 0,0025- 0,0035; трифенилтетразолиум хлористый 0,002-0,004; дистиллированная вода ос тальное. Среда обладает более высокими селективными свойствами по отношению к сальмонеллам, чем известные среды, . обеспечивает визуальное отличие колоний.сальмонелл от культур, ферментирующих лактозу и сахарозу. 2 табл,Состав среды Левина, мас,0 :Лактоза , 2,0Метиленовый синий 0,01.Эозий желтый 0,03Калий фосфорно-кислыйдвузамещенный 0,2Питательный агар Остальное Сальмонеллы на этой среде растут в виде прозрачных, бесцветных или слаборозового оттенка колоний. Ешерихии образуют синие или черные колонйи, протей - оранжевого оттенка колонии, Смесь этих культур трудно дифференцируются. Кроме того, недостатком среды является низкая селективность недостаточно задерживается рост посторонней микрофлоры,Известна селективная среда висмут - тиллированная вода, дополнительно содерсульфитный агарсостава, мас.%: жит сахарозу, а в качестве индикатора -Мясной экстракт 0,5 . трифенилтетразолиум хлористый и малахиПептон 1,0 товый зеленый при следующем соотношеГлюкоза 0,5 5 нии компонентов, мас,%;Натрий фосфорно-кислый . Питательный агар 3,9-4,5двузамещенный 0,4 Калий фосфорно-кислыйСульфат железа 0,3 двузамещенный 0,25-0,35Сульфат висмута0,8. Лактоза 1,0 - 2,0Бриллиантовый зеленый 0,0025 10 Сахароза 1,0 - 2,0Агар . - 2,0 . Стерильная желчь крупВода.:,; ., Остальное ного рогатого скота 5,0-15,0Среда, разлитаяв чашки Петри, хранит-Малахитовый зеленый 0,0025 - 0,0035ся при 4+2 С и используется не ранее 24 ч и Трифенилтетразолиум:. не позже 5 дн 15 хлористый 0,002-0,004Недостатком этой среды является то, что Дистилированнаяне все виды сальмонелл дают на ней харак-водаОстальноетерные колойии черного цвета с металличе- Сопоставительный анализ предложенс ком блеском и почернение среды под ного состава среды с известной средой(проколониями, В тоже время отдельные куль тотипом) показывает, что предложенньй. туры, не относящиесяк роду сальмонелла, состав отличается введением в него в качедают колонии на этой среде, схожие с коло-. стве индикатора трифенилтетразолиуманиями сальмонелл, Кроме того, протей рас-хлористого и спиртового раствора малахитет в Н-форме,:, . товогозеленого, а также сахарозы,Наиболее близкой к изобретению являДля экспериментальной проверкиется среда РЖследующего состава,предлагаемого состава были приготовлемас.%:,; ны пять смесей ингредиентов, три из котоЛактоза. 2,0 . рых показали оптимальные результаты (см.Калйй фосфорно-кйслый : табл, 1),двузамещенный 0,3 .30 В состав пяти вариантов сред входилиСтерильная желчь круп- : . соответственно, в мас. %:ного рогатого скота 10,0 . .,.:.: .И И 1 Ч ЧГ 1 итательный агар 5,0 .. ПитательныйБриллиантовый зеленый 0,002 агар 3,8 3,9 4,0 4.5 5,0Дистиллированная .:.,35 Калий фосфорновода Остальное . кислый двузамеСреда разливается в пробирки. Иссле-, щенный . 0,1 0,25 0,3 0,35 0,4дуемый материал вносится в среду для даль- Лактоза 0,4 1,0 1,5 2,0 3;0нейшей инкубации, При работе с чистымиСахароза- 0,4 1,0 1,5 2,0 3,0культурами среда обеспечивает дифферен Стерильная желчьцировку сальмонелл от кишечной палочки, крупного рогатогООднако при смеси этих культур результат скота ., 2,0.5,0 10,0 15,020,0оценкисреды затруднен и зависит от коли- Малахитовыйчественного соотношения сальмонелл и зеленый 0,001 0,003 0,01бактерий групп кишечных палочек, Протей45 :0,0025 0,0035дает аналогичнйе с сальмонеллами измене- Трифенилтетразония среды, При использовании среды в чаш- лиум хлоках Петри колонйи сальмонелл и кишечныхристый 0,001 0,003 0,02палочек плохо дифференцируются, Оба ви-.: . .:: .0,002 0,004да растут в виде молочного цвета, мутных 50Дистиллировай- колоний. Протей растет колониями практи-: ., ная вода Ос- Ос- Ос- Ос Осчески одинаковыми с колониями сальмо- , .таль-таль-таль-таль-таль ное ное ное ное ноеЦель изобретения - улучшение диффе- При приготовлении сред использовалиренцирующих свойств среды. 55 1%-ный спиртовый раствор малахитовогоДлядостиженияуказаннойцелииэвест- зеленого, 0,40/,-ньй водный раствор трифеная среда, в состав которой входит ййта-нилтетразолиума хлористого, калий фостельный агар, калий фосфорно-кислый форно-кислый двузамещенный, лактозу,двузамещенный,лактоза, стерильная желчь сахарозу, желчь крупного рогатого скота,крупного рогатого скота, индикатор и дис%-ный спиртовый раствор. малахитового10 30 35 40 50 зеленого, питательный агар. Ингредиенты растворяли последовательно после полного растворения предыдущего при подогреве, доводили до кипения, Автоклавировали под текучим паром (100 С) 15 мин; Цвет среды после автоклавирования зеленый. Посевы инкубировали при 37+1 С 24-48 ч, рН среды после автоклавирования находится в пределах 7,0 - 7,2.В табл. 2 представлены данные о характере роста бактериальных культур на испытуемых вариантах сред Бактериальные культуры использовались после оживления - четырехкратного ежесуточного пассажирования на мясопептонном бульоне,В качестве примера роста лактозоферментирующих микроорганизмов использовали Е, соП 675, в качестве примера роста сахарозоферменти рующих микроорганизмов - Рготецз чццаг 1 з. Рост культур проявляется через 16 - 18 ч, 20 но интенсивную окраску колонии приобретают через 22-26 ч. На всех вариантах сред культуры растут в Я-форме, рост культур ЯтарЬ, цтецз, М 1 сг. 1 узоде 1 ст 1 сцз, Вас,сегецз, Вас, зцбт 111 з, ЯтарЬ. ацгецз, Ятг;1 ес 1 ц гп и ол но стью задержи ва ется. Свои свойства среда при хранении при комнатной температуре, разлитая в колбы по 200 мл, сохраняет в течение 1,5 мес, разлитой в чашки Петри - . 14 дн (срок исследования) Оптимальные результаты получены при использовании 2, 3 и 4 вариантов сред. Колонии протея на этих средах темно-голубого цвета, ровные, блестящиевлажные, Колонии кишечных палочек голубого цвета, ров: ные, блестящие, влажные. Эти две культуры . не изменяют цвет среды. Колонии сальмонелл коричневые различных оттенков. Центральная часть колоний Я. оа 11 пагцгп:рцИогцгп может быть окрашена в вишневый:цвет. Культурьг сальмонелл изменяют цвет среды вокруг колоний с зеленого до светло- коричневого. В первом варианте среды колонии ки шечных палочек серые с коричневым или слабым зеленым оттенком, Цвет среды вокруг колоний изменен от светло-зеленого до серо-коричневого, Колонии протея - серые,бледно-голубые, Колонии сальмонелл схо. жи по цвету и характеру колоний с колониями кишечных палочек, поэтому визуальная дифференциация этих культур затруднена.Следовательно, содеркание компонентов в этом варианте среды следует считать запредельным,В 5-м варианте среды происходит значительное угнетение культур, в том числе сальмонелл, особенно 5. ца 11 пагцгпрц огцп, поэтому содержание компонентовв этом варианте среды следует считать запредельным,.Оптимальное содержание малахитового зеленого в этих средах находится впределах 0,0025 - 0,0035 мэс.%. При уменьшении концентрации малахитового зеленого ниже 0,0025 мас. % колонии кишечныхпалочек окрашиваются в серо-коричневыйцвет, колонии протея - бледно-.голубой. Этозатрудняет вйзуальную дифференцйациюэтих культур от колоний сальмонелл, Приувеличении концентрации малахитового зеленого больше 0,0035 мас. % происходитзначительное угнетение культур, в том числесальмонелл, Поэтому концентрации малахитовогозеленого меньше 0,0025 мас. % ибольше 0,0035 мас. % следует считать запредельными,Оптимальное содержание лактозы 1,0-.2,0 мас,%) обеспечивает голубую окраскукул ьтур, ферм ентирующих л а ктозу. П ри содержании лактозы 0,4 мас.% и ниже колонии кишечных палочек серые с коричневым .оттенком, Это затрудняет визуальную дифференциацию этих культур от колоний сальмонелл, Поэтоглу концентрацию лактозыменьше 1;0 мас, % следует считать запредельным. Увеличение содержания лэктозыболее 2,0 мас, % считается нецелесообразным, так как это не приводит к изменениюокраски колоний,Оптимальное содержание сахарозы находится в пределах 1,0 - 2.0 мас,%. которыйпозволяет определить наличие сахарозоферментирующих свойств исследуемыхкультур и обеспечивает голубую окраску ихколоний. При уменьшении сэхарозы меньше 1,0 мас. % колонии протея приобретаютболее бледно-голубую окраску, Это затрудняет визуальную дифференциацию этихкультур от колоний сальмонелл. Поэтомуконцентрацию сахарозы менее 1,0 мас, %следует считать запредельной, Увеличение содержания сахарозы более 2,0 мас. %считается нецелесообразным, так как этоне приводит к изменению окраски колоний.Оптимальное содержание трифенилтетразолиума хлористого находится в пределах0,002-0,004 мас,%, который обеспечиваетокраску колоний сальмонелл в коричневыйцвет. Уменьшение содержания трифенилтетразолиума хлористого ниже 0;002 мас. %приводит к более бледной окраске колонийсальмонелл, которая все больше приобретает Серый цвет и теряет коричневый оттенок,Увеличение содержания трифенилтетразолиума хлористого более 0,004 мэс, % приво- .1758076 20 7дит к значительному ингибированию культур,особенно Я, цаИ 1 пагцв-роИогцп, Следовательно,концентрациитрифенилтетразолиума хлористого меньше 0,002 и больше 0,004 мас. оявляются запредельными,Оптимальное содержание питательногоагара 3,9-4,5 мас. ,4, При уменьшении содержания ниже 3,9 мас.; среда получаетсянедостаточно плотной, что создает определейное неудобство при посеве исследуемого материала. Увеличение содержанияпитательного агара более 4,5 мас. Оь приводит к получению очень плотной среды. Этотребует большего времени при разогревесреды и увеличивает риск разложения углеродов при нагревании. Поэтомуконцентрации питательного агара меньше 3,9 и более4,5 мас. о являются запредельными.Оптимальное содержание калия фосфорно-кислого двузамещенного находитсяв пределах 0,25-0,35 мас, . При уменьшении его содержания менее 0,25 мас. о про. исходит уменьшение буферности среды,При увеличении содержания калия фосфорно-кислого двузамещенного более 0,35 мас.ф изменений в окраске и характере ростаколоний не происходит, Поэтому концентрации калия фосфорно-кислого двузамещенного меньше 0,25 и более 0,35 мас.Дявляются запредельными.Оптимальное содержание стерильнойжелчи крупного рогатого скота находится впределах 5,0-15,0 мас. о. Уменьшение со.- держания стерильной желчи крупного рогатого скота меньше 5,0 мас. о приводит куменьшению ингибиторных свойств среды". по отношению к другим микроорганизмам.Увеличение содержания стерильной желчикрупного рогатого скота с 15,0 до 20,0 мас:%. приводит к увеличению ингибиторныхсвойств среды и задержке роста Я.,9 а 111 пагцв-роПогца. Поэтому концентрациистерильной желчи крупного рогатого скотаменьше 5,0 и более 15,0 мас, Д являютсязапредельными.4 ) Рост культур сальмонелл, кишечных палочек, протея проявляется через 16-18 ч.Интенсивную окраску колонии приобретают через 22 - 26 ч, Колонии сальмонелл име 5 ют коричневую окраску, колонии Е. соИ,Рго 1 ецз чц 19 агз голубые, возможен зеле- .ный оттенок. Рост других микроорганизмов. Возможно применение среды путемпрямого посева исследуемого материала15 без предварительного посева на жидкие селективные среды накопления. Это позволяет сократить сроки исследования насальмонеллы с 5-ти до 3-х суток,Формула изобретенияПитательная среда для выявления сальмонелл, содержащая питательный агар, калий фосфорно-кислый двузамещенный, 25 лактозу, стерильную желчь крупного рогатого скота, индикатор и дистиллированную воду, отл ича ю щая ся тем, что, с цельюулучшения дифференцирующих свойствсреды, она дополнительно содержит саха розу, а в качестве индикатора - трифенилтетразолиум хлористый и малахитовый .зеленый при следующем соотношении компонентов, мас. :Питательный агар 3,9 - 4,5 35 Калий фосфорно-кислыйдвузамещенный 0,25-0,35Лактоза1,00 - 2,00Сахароза 1,00-2,00Стерильная желчь круп 40 ного рогатого скота 5,0-15,0Малахитовый зеленый 0.0025-0,0035Трифейилтетра зол иумхлористый 0,002-0,004Дистиллированная45 вода . Остальное1758076 Табл и ца. 1 Состав испытуемых вариантов сРеды ца 2 слытуеиых взриантах сред та куль ктеьФ 2 3чи ультураФ13В,е Фан средм зелеймйколонии блестящиенутные, округлыеООВНМЕ ВЛЗЦЛ 1 ЫЕкоричневые,центркопоний нс вмракс 1Цвет среды вокругколоний изменяет"ся от зеленого досаетпэ"коричневого сет 1 с 1 а 1 в Фон средызелены 11 котюнии блес-тящие, нутнме,акрутгые,роение,апаиные,коричне-.выецентр колонийне аыракен, ЦветСРЕДЫ ВОКРУГ Калоний изменен досветло-коринес фон среды светла" ЭЕЛЕНЫЯ 1 КОЛОНИИ блестяцнс,мутные, округлмс,равные; влакнме, сает юкоричневма с бо лес тсннмм цент Ром е виде точки, Цест срепм вокруг колоний изменяетсл до светло.ко" ричневаго он среди зеле алонии блестя утице,округлы ровные, апакнме ОРчневые, ца оланид иевмр ен. Цвет сред округ колоний еняется от зе о досветло-к свого Фон средм теи 1ЭЕЛСИЫФ КОЛОблестящие;иуюок руг пме, ровывлакнме кориеые с (ил бетемно-вимневыицентром, Цветсреды вокругний иэиеняетстенко.эеленогдо темна.раза ЬЬие,и нсно ич. ч и УРЪьмццЪ 11 ц и ию 1 еге вцх Фан среды пений; ко тящие окрные,кори синчатыеь зрачные, " темно-эелонии бпссуглме влащ чнеаые,ро палУОРО" Ва 11 Ьвтцщ11 аппь Фои среды зеленейколонии блестящие Округлые 1 влахимемутные,ровные,росинчатые с голубим оттенком. Е.со 11 6 те фоч среды зеленый,коюнцы блестящие, округтььеьвлакные"иутнме;ровные, теиио"голубые, рааноиерно окраценнме,Фон среды зеленый,отюнии блестящие,круглые,вламные,утные,ровные;гоубые,равноиетиоокращснные,фон среди зеленый,копании блестящие,Округлые,влэвные,мутные,раенВголубые серо-Голубые, со слабо вы-ракенныи центромгрязно-голубогоцвета.Нет роста Фо реди теиной, колонии щиеОкругчьее,бледно-гас синеватыои,зелены блестя вязким отта та Нет рос Вс,ацсеыз Пэс.Вс,ецтецв 100ВСЗРЬ 1 цеецвН 1 ст.11 во 4 с 1 ссбсцв 1 ет рост т роста т То ме То ке и и и и 11 и и с. зцЬсь 1 с, сетец и иэижФон средм зеленки,. колонии блестя-ще,округлые,влажные,серые скорнисеми оттенкон; вокруг коломний цвет средыизменен да светла"коричневого.25 " ФЗи срепы зеленый,колонии блестящие,округлые,ялаииме,иутнмс, Роллне, серые со слабин зеленыи иги светла коричневыи оттакмь,В иестах густогораста копоний средасветло-коричневая.С,тц 1 Вагфз Фон среды зеюный,колонии блестящие,Округлил,впаянно,мутные,равные, се"рые с зелено-гопубыи оттенком, сцентром грязно"голубого цвета,фан средм Зелены, Фон среды зеленый, колонии бпестяув 1 е, колонии блестлщие округлые,влвииые, округлмс, впэмиые, КОРИЧНЕВЫЕЛолу- КОРИЧНЕВЫЕ, ВОЛУ- прозрачные,вокруг прозрачные,вокруг копоний просветле. колоний среда приние средм со свет- обретает кор 1 аело-коричнеаыи от- вый оттенок, тонком.ФОИ СРЕДЫ ЭЕЛЕИМД, ФОИ СРЕДЫ Запаный колонии блестящие, колонии блестящие, округьвеалакные Округлые,влахиые, иутнметрбв 1 неголу- мутные,ровные,го" бнс с более лркии лубые, с более голубцы центром. яркни голубыи цаиРои. фон среды зеленый,копании блестящие,Округлмеьвламиыеькоричневым папупрозрачные,вокругколоний среда приобретает незначи-тельныд коричнавый оттенок,фон среды зелснмй,колонии блестящие,окоугга 1 е 1 влэмнме 1путные, ровные; голу- бые с более интенсивно окрамеиньэьцентрои,