Способ выделения миелопероксидазы

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТ ИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 37/4 11 С 12 И 9/08 ееъ ееее. 4 е е,е,ш,1 КЗОБРЕ 7 ЕЯИЙДЕTЕПЬСТВ У ВТОРСИОМ ч ров гел ОСУДАРСТВЕННцй НОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИей И ОТНРЬЩМ(71) Ленинградский ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. А.А. Жданова(5 б) 1, МаЬезоп И,В., Иоп 8 Р,Б Тгач 1 в Ч. 1 зо 1 аг.хоп апй ргорегг.1 ез оГ 1 шщап пецсгорЬ 11 пуе 1 орегохйаазее - "В 1 осЬеппзйгу", 1981, 7 о 1, 20, В 2, р, 325-330.2, Шафран М.Г, Выделение и некоторые свойства миелопероксидазы костного мозга человека.- Вопросы медицинской химии", 1979, Р 2, с, 149-153. (54)(57) 1. СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ МИЕЛОПЕРОКСИДАЗЫ из клеток костного мозга человека путем гемолиза эритроцитов солевым раствором, отделения лейкоцитов и экстрагирования Фермента с последующей ионообменной хроматограФической очисткой и гельфильтрацией, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повьпцения выхода и активности фермента и упрощения процесса, используют сырье в криоконсерви;ованном виде, для гемолиза ыритроци.ов используют изотонический раствор ННС 1, а для экстрагирования фермента - раствор катионного детергента, хроматографическую очистку осуществляют на катионоооменном сефадексе, содержащем группу -О-С Н - 80 - .е2. Способ по и, 1. о т л и ч а юш и й с я тем, что =- качестве катион =, ного,цетергента используют цетнлтрниетнламмоннйброннл о концентрацией Ееа в растворе 1-27.3, Способ по пп. 1 и 2, о т л и- ( а ю щ и й с я тем, что ыкстрагиание Фермента, его очистку и ьфильтрацию проводят в водном растворе СНСООИа и МаС 1.1113407 тдх Изобретение относится к биохимии, частности к с(особам цзвлеченияФерментов (энзимов), ц может быть использовано для получения препаратив нога средства в клинической и экспе римецтальной медицине, а также в Фармакологической промышлецностии,Известен способ выделения миелопероксиддзы из лейкоцитов крови млекопитающих путем экстракции детергентам или раствором с высокой ионнаЯ силой с последующей очисткой 113Данным способом можно получить значительное количество лишь ксецогенного, т.е, выделеццого из лейкоци- "тов крови животных препарата, чтос У Щ е с т в е н 1 О 0 Г 1) д ц и ч и В сэ е т с ф е т) У Р Г Оиспользования, в частцос.тц, в лечебе(ой практике. Для получения приГОДИОЙ Для клиническоГО исп 051 ьзова ция миелопероксидазы из лейкоцитовчеловека требуется заготовить бо:ишие количеств;3 необходимой для переливания больным ц дорОЕОстоящейДСтцОРСКОЙ КРОЕ 1 сс. КРОКЕ ТОГО р (с)(тЕР - 25кдцие миелопероксцдазы в зрелых клетках мис.лоид 1010 1)Я"д ГРсдцУлОЦитдх периферической кровц зцачительЦО Ц 1 ОКО, с(ЕМ В МРЛО 1 ЫХ К.1(1 КДХ ЭТОГО ер 5 дл, 1 Особ(пно Г т 11 13 рстю 10.10 ти )е Н;1 бо с(. е б (тиз Рк к пр(.;131 д 1 демому по технической сущности ц цостцгаемому резутитату сносб выдетеция мцелоперокс Ддзы 1: к:тсток костного МОЗГД ЧстОВЕКД - КО( ТО-МОЗГОВОЙ взвеси путем гемо 1:д ;рцтроццтов гцпотоцчеекм раствором - О, 237 - цым раСтцара. ХсС. ОтлсЛЕ 1(я 1 Ейк(цтоЗ)4( выделения .цэосомдльцой фракции цз лс йкоццтов дцффер цццц(ь 1 ы 1 цецтрцфугироцдцием, кетрд цровдцця цз цее ф(РМ(цтсд с - цс,1 М Рс( ТВО)ОМ (1 дС 1 В фосфдсОМ (,с,(ьс,(р( ( НО) сто(лс:4 Д У к) 111 ц м; Е ц дц 1 3 О м ) к е Н ) д 1( т д, Очисткой мцелоперокс.ц;(азы цоцообмеццой хром сэ т 01 с(1)ц е и ц с к О:1 О ц к е с )1 ЕЛЕ С (ф с 1" дексом Л-О (УРдвцовескецой От 1 (1 Фосфдтцым буферам, рН 7,0) ц цд ко)О ланке с Кк 1-пел(к)лазо (урдццовешеццой 0,05 )с 1 фосфдтцым буфером, рН ",О) ц ГЕ)Ьфцтцттрсдцц(Обс 11 О цд К(;.с(01:КЕ С ссефддекс(тм С - 100, урдвцстешеццой О, 1"1 фосфдтц(ЕМ б.(ре)Оы, рН 7, О, с 0,1 1(1 11(С 1. ПО( тд;111 цд)1 тс пятерне 11 д тгВЕ(тцОГ:) ЕП )Е; б, (;ОТ .В" Ет(д В абп 1,Недоста,ками известного способа являк)тся невысокие выход и активность выделяемого Фермента, а также многостддийность способа. В частности, как видно из таблицы, из 2,0 10 клеток удается выделить из экстракта (,3 мг миелопероксидазы (163).Известный способ выделения мцело -пероксидазы предусматривает испсльэовацце в качестве исходного сырьявзвесь из свежезаготовленного костцого мозга человека, чта обусловливает необходимость немедленного начала процесса выделения миелопероксилаы, так как хранение костномозговой взвеси при положительных емпературдх приводит к гибели лейкоцитов и разрушению сопержашейся в цих миелопероксидазы (замораживание костцо мозГОВОЙ ВЭВеси пи От сутствиц криоконсервантов исключдетея цз-зд лсструкции к:теток), а сакже пот, чепце ливи, ебольИх количеств препарата цз-зд о ссутствия возмож -О(.т: Одновременной заготовки исходного сырья - костного мозга от большао числа доноров цли трупов скоро -постижцо умерш х людей, ПрименениеЭТОГО СПОС Оба ;1,.(1 я ВЫДЕЛЕцня МИЕ.Опероксцддзь 1 цз клеток крцокоцсервцроцдццаго костцоГО мозга невозможнопоскольку в прьсутстг)еи криокоц:ервдцтов 1 е удается асуп(ествцть фрдкцц( ццрсвдцие клеток и соловую экст -рдкт цю,Наряду с этим способ цс ГардцтирусТ ДОСТдТОЧИЫЙ ВЫХОП МИССОПЕрокс Ида ы из-зд зцдчитс:(ьпых потерьфермс цтд в процсссе Гипотоццческого;1 зцед эрцтроццтоц (сопровожддюшего -ся рдзрушсием части лейкоцитов) ипри выделении лцзосомальной фракцииВ ходе дифференциального центрифугировдцця (потеря ферм(цта до 707.),УКаэдццшй С 1(ОСОб ВЫДЕЛЕцця МИЕ -;Опеокс)1,(сз:31 с многа стадийный31013) сКЛЮЧа(.Т 1 аРЯДУ С ЭТаПОМполучецця субклеточцой (лизосомальЦай) (РРД 1 Цтц ДЛИтЕЛЬНЫй ДИаЛИЗ СОлевого экстракта ,20 ч), малоэффективный этап счцстки миелопероксцдаы из дцдлцзатд иоцообменной хроматографией на ДЕЛЕ-Сефадексе А(Очистка в 1,2 рдзд), ионоабмен уюхроматографию цд КМ-целлюлозе и Гельфильтрацию ца Сефддакс.е С. Кроме того, полученный препаэат миелопероксцддзы характеризуется низ4 О Осуществление в соответствии спредлагаемым способом гемолиза эритрокой удельной активностью около 1800 ед./мг белка, что является следствием воздействия неблагоприятных факторов (например, протеолитических ферментов) в результате дли 5 тельного ведения процесса.Цель изобретения - повышение выхода и активности миелопероксидазы, а также упрощение процесса выделения.Поставленная цель достигается 1 О тем, что согласно способу вьделения миелопероксидазы из клеток костного мозга человека путем гемолиза эритроцитов солевым раствором, отделения лейкоцитов и экстрагирования фермен та с последующей ионообменной хроматографической очисткой и гель- Фильтрацией, используют сырье в криоконсервированном виде, для гемолиза эритроцитов используют изотони ческий раствор БНС 1, а для экстрагирования фермента - раствор катион- ного детергента (обычно цетилтриметил - аммонийбромид с концентрацией в растворе 1-2%), хроматографическую очистку осуществляют на катиоцообменном сефадаксг, содержащем группу - -О-С,Н - Ю, - .Экстрагирование Фермента, его очистку и гельфильтрацию проводят ЗО в водном растворе СН,СООБа и ИаС 1.Использование в качестве источника получения миелопероксидазы криоконсервировацного костного мозга человека обеспечивает значигельное расширение сырьевой базы для получения фермента, так как криоконсервирование костного мозга при ультранизких температурах (-194 С, жидкий азот) позволяет избежать деструкции клеток и создать долгосрочно хранящийся запас морфо-Функционально полноценных миелокариоцитов, т.е, накопить исходное сырье в неограниченном количестве.45Упрощение способа получения миелопероксидазы из лейкоцитов человека благодаря присутствию в костномозговой суспецзии экстрацеллюлярных криоконсервацтов, близких к мембранным структурам клеток способст,- вует удалению балластного мембранного материала и упрощает последующую очистку миелопероксидазы, что в дальнейшем сказывается на сохранении активности фермента. цитов в суспензии клеток костного мозга изотоническим раствором ИНС 1 обеспечивает более щадящие условия для клеток миелоидного ряда, не вызывая в отличие от гипоточического раствора ИаС 1 значительного лизиса лейкоцитов, в особенности их незрелых форм, содержащих повышенные количества миелопероксидазы, и, следовательно потери Фермента уже на первых этапах его вьделения.Для реализации предлагаемого способа, кроме цетилтриметиламмонийбромида, могут быть использованы идругие тиjы катионовых детергентов, поскольку в них заключены аналогичные свойства: дезицтеграция мембранного материала, осаждение в составе мицелл мембран и отрицательнозаряженных молекул (белков, нуклеиновых кислот, гликозаминогликанов),а также преимущественная солюбилизация катионовых белков путем вытеснения их катионовым детергентомиз комплексов с отрицательно заряженным материалом. Детергент в отличие от применяемого в известномспособе солевого экстрагента позволяет вести экстракцию миелопероксидазы непосредственно из лейкоцитов(миелокариоцитов), а не из предварительно вьделенной из них субклеточной (лизосомальной) фракции.Это обеспечивает значительное упрощение процесса вьделения миелопероксидазы по сравнению с известнымспособом, так как позволяет исключить.из процесса два этапа: дифференциальное центрифугирование, необходимое для выделения лизосомальнойфракции и многочасовой диализ экстракта перед ионообменной хроматографией, тем самым влияя на выходи активность фермента. Наряду с этимцетилтриметиламмонийбромид позволяетосуществлять экстракцию в присутствии криоконсервацтов, исключающихсолевую экстракцию вследствие образования желеобразного несуспецдируемого осадка,В качестве сорбента при хроматографической очистке используют БР-Сефадекса Сиз-за наличия у негокак наиболее сильной, так и наиболееэкспонированной (длинной) связывающей группировки -О-С,Н - БО, в , чтопозволяет вести очистку миелопероксидазы при тех же условиях (рН 6,0),7:,тяпах выделсния миелоперсксидазыединым гдствором (СН СОО 1 а .: К 1 ЛС 1 в;1,О) ., что существенно про 11,;1 етцесс, я также способствует сскрлще.ни 1 о числа стадий и ссхраненц 1 о актив .ости Фермета.Предлагаеь 1 ыц способ позволяетСС;.сИ".Ь ЧИСЛ 0 СтДИЦ П 1, ПССС Свыделением Фермента в бсл 1 шем коли -честве (14-16,6 мг) и с большейактивностью (500000-600000 ед/мгбелка),.Общая продолжительность процесса01 ав 1 яет 18-32;лзмороженнсго криокос 1 срвироваццсгс 1 ЦИЗЛЦИЦ КЛЕТОК ИСПОЛЬЗУ от Г гениздтор типа Даунс.а (с 11 к.1 с Гомоге 11 ат перемешивают цл шут аппарате в течение 12-14 ч, и фугируют 60 мцц при 5000 си дочцую жидкость (красно-бур:11 содержащий 5 - 7. персксцллзцсй 0 М 0- -СТРКЛ 0)С 1 С 1 це ц т р ни ад с с лр л с. т в о рДКТЦВ ,гобразомОсадок ности, определяемой, глав 11 м примесью гемсглобицд) удд.по гсмогеццзцруют в 1-2.-цом рдс цетцлтрцметцлдммоцицбрсмилл ( ленном ца 0,1 М СН, СООМл в О, и цсцтрифугцрунт при 5000 т 60 мин: Эту происдуру ( Гсмсге с центрцфугцрсвлцц м) повторя Т В 0Епри гстсвв1 М МЛС 10ц:сзацияСТ ЧЕТ 11 -ре раза, после чего ссадок удаляют,костного мозга человека осджпаютцецтрифугированием при 600в тече О цие 15 мин. Надосадочную жидкость удаляют, я осадок клетс:с обрлбаты- Ва 1 ОТ Г,837 - НЫМ ВсдЬП 1 рдетлсрОМХН С 1 (прц состспеции 0: ъемсв раствор - осадок 1 С:1) Миелокариоциты осаждают при 600 в течение 5 ми 1 общее время экспсзигнси клетокв 1 аствсре Ю С не ;10 лжцс преп.1 шлт 1. МЦП, .;С 1 УЧР 1 Ь 1 КЛЕТЛЧ 111:СЛЛОК- г.вл 1 сь ст:"ывают О, 8ц 1 . Л. 0 Б . торным цецтрифугцрсвс 1 ие. 11 рц 00и теч нис 15 миц, ца 110 слдсч:1 у 1 с, жц 1- кость удаляют. Отмытый осадок белых10клеток 1,2, Ох 10 клеток) гс;могець 1 зц - руют в 1-21-цсм растворе цгцлтрцмеш 1 ламмонийбромида (пригстов,ценом ца 0 1 М СН СООГца в О, М,.16 ) ппи соотношении объемов 1:1, ля 10 моа нлдосадоч 1, 1 е жидкости (зеленого цве" тл) объедия 1 от и цецтрифугируют при 10000060 миц. Полученный зеленыцй раствор ,экстрлк 1) наносят на колонну 2,5 х 8 см), заполненную БР-Се - фадсксом Си уравновешенную 0,1 М СНСООЯа в 01 1 ЛС 1. Адсорбировлццый ца колонке материал (темцо-зелецсгс цвета) цромыва 1 от 01 М СН СО 01 яО 2 М лС 1 Объем 1 ромыв 10 й жидк;стц составляет 3-4 объема колонки 1,выход балластного материала с колонки регистрируют спектрофотометрически при Я 280 и 230 нм). Адссрбирсвяцную ня колонке миелоперсксцдазу снимают раствором 01 С:. ССОКЛ в 028 М 1 ЛС 1, Выход Фер цтаКОЛОНКИ рГИСтрнруЮт СПЕ: . рсфотомстрически при 430 нм. Миелопе роксидазу после иоцообменной хрома-. тографии подвергают дальнейшей очцст. к 1 ел ьфильтрацией на колонке 12,5 х 60 см), заполненной Сефадексо 1 "-100 и уравновец;еннсй 0,1 М СН,СООа в 0,1 М ХЛС 1. Фермент элюируют через кспсцку этим же раствором со ско;остью 25-30 мл/ 1..с;С садцй:1 ая ХарантрцетИКа ПрЕд,Д Г Лс 11 спо С 10 С С; Са Пс СТДЕЛ 1111 лиям сц,1 ецд в табл, 2,с 1 РМ 1. тат ИВЛЯ ЛКТИВНОСТт МЛЕЛОлсроксидлзы, д .лкже количествобе:1 кд Опредля 1 от лнало 1 ичнс извес" цсму спососу.Кдк видно и 1 табл. 2, предлага- мым способом из 2 ОК 10 клеток удлтся в 1 пелит 1 около 14-16,6 мг очищен 01 0 коцеч 01 0 продукта, что в- раз д превы 111 лет количество миР;10 сроксидазы, получаемой известнымсособом. Выде:1 ен 11 Й препарат миелопсрсксидлзы очищен в 25 раз, обла,1 дет удельной активностью 500000600000 едмг белка (т.е, фермент вО раз болсс активе, чем выделен 1 й известным С 1 особом) и степеньючистоты (от сшенце оптической плотссти гтги длине волы с 11 430 нм к оптической плотности при 3 280 нм, ,1.0 Е г- тяццаРтНЫй КРИтЕРИйчистоты мие.10 ерсксцдаз) равной0,81 - 0,83. Выход фермента после конечного эгапл очистки составляет 30-.4 Ж.1113407 Таблица 1Результаты выделения фермента известным способом Количество белка,мг Этапыочистки Степень Степень очистки чистоты Гомогенатлизосом 696,0 Экстракт 160,2 Диализ 111,6 100 8,3 9,0 ДЕАЕ-Сефадекс А79,2 0,20-0,34 10,0 3583,3 КИ-целлюлоза 0,50-0,60 48,4 36 17578,3 10,0 СефадексС18309,0 4,3 16 50,5 0,76 Таблица 2 Выход,7.Степень очистки Этапыочистки Степень чистоты Удельная Количество белка,мг ЕФЗа/Е ) Для 17-ного экстракта 100 0,1 21000 22000000 1050 Экстракт 51 0,58 15 0,81 25 34,4 11320000 324000 14,0 7500000 535000 Для 27-ного экстракта 1422 34120000 43,2 14606000 100 0,1 24000338000 ЭкстрактЯР-СефадексС0,056 14 СефадексС16,6 10160000 612000 0,83 30 ЗНИИПИ Заказ 6529/21 Тираж 521 По писиое ЯФилиал НПП "Патейт, г.ужгород, ул,Проектная, 4 БР-СефадексС СефадексСУдельнаяактивностьединицы на1 мг белка 362,0 3033 ь 7 3279,5 Суммарная активность, единицы активности активность,единицына 1 мгбелка 8Выход,7