Способ культивирования гибридом

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 801109437 А Э(5 И С 12 М 15/00 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(71) Институт биологической ФизикиАН СССР(56) 1, Ге 1 гоп Р.Е. ег а 1. Сиггепггорся 1.п Г 11 егоЬо 1 ояу апс 1 1 пппцпо 1 ояу.1978, 8 1, р. 1-7.2. Аяга 1 Й 1 С.С.В. ег а 1. Ргог 1 с 1 еяоГ гпе Ьго 1 оя 1 са 1 г 1 иЫя. 1980, р.28,р. 443-458 (прототип).(54) (57) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ГИБ, РИДОМ на питательной среде с добавлением сыворотки животных, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения продолжительности продуктивного периода синтеза антител, в качестве сыворотки животных используют свиную сыворотку.Изсореение относится к 7 муцалс 1 ии и к 1 сается сеособа куеьеИГьООна - ния п у 1 е: го 1 царицам (искусстве еено созданных гцбридньгх клеток, продуцируюцих моноклоцальнье аеетлтелее, иможет найти применение в медицине, ветеринарии, вирусологии, оькогОе Еее, биахиыи, бистРхналс"ии цля ГОхГц Р - нця определенно заданных мснсклональных антител, которые используются, 1 О ееапример, дл 51 рацееР 1 диа гна сЕЛ 1 кц рак а и других заболеваний ка.к человека, так и животных; для высокоэффективной ачистк. и Голучеция биологически активных белков (например, интер ферона), для химцо- и цммуцотерапии,В 1975 г созданы солеатцеские гибриды к;еток млекопцтаюпих (гибридомы), которьЕе продуцировали "числтые или монсклоцалыые антитела, 20 Препараты моцоклональных антител получаОт либо из асцитцай жидкости прц культивировании гибридом и уло, либо из культуральцой жидкости (кле точный супернатант) при культивировании гибридом Гп Йцго, Для этого отбирают те гибридомы, которые обладают наибольшей стабцльееостью ц высокой продуктивеОстью. Под стабиль 30 пастью подразумевается длительное сохранееие способности к образованию антител (т.еантителопродуцирующей способности) при непрерывном культивировании. Продуктивность вэта спо 35 собность клеток клона производить определенное количество антител. Стабильные клоны с разной продуктивностью удается получать на раннем этапе ныделеция гибрцдом, но зцачитегеьная часть клонов (может быть 2-3)40 обычно теряет способность к синтезу антител через 3-О цедель непрерывного культивировании. При этом утрата основного признака це зависит ог спосаба куепьтивирования з.п еело (асцигная форма) или Гп уьсго, Это является одним цз основных факторов препятст 1 зуОщх промьшеле 1 П 10 му пслу-есниен моноклональных аеттел, Нужно отметить, что межвидовые гибридомы (мьгиь х человек, крыса х человек ц т,д) являются всегда нестабильцымц,так как происходит быстрая элиминацияхромосом человека, Поэтому увеличение продолжительности продуктивногопериода сццтезч антитеге такими гиоридомами хотя бы на. несколько Еепель является больил успехом. Известен способ культивирования гизрцдом на питательной среде Д 1 Е 11 (еецтателея среда Игла, модифицирое;аннан Дальбекко) с добавлением эмб - риональпой сыворотки коров13.11 едостаток этого способа заключается в гам, что при ееепрерывном кУльтеенрсвалиц гибридом в такой питательной среде они теряют свою ГСХОппьЕО аТЕТЕЛОГРОДУЦИРУ 01 ЦУЕО СПО собцост (стабильность) через 3- 10 недель культивирования (в зависимости от свойств гибридомы) . Другой недостаток этого способа состоит н ьеобходилость добавлять в питатепьную среду эмбриональную сыворотку коров, которая является весьма доро астс 5 л и дефицитным компонентом пцтатслыОЙ среде 1,ниболее близким к изобретениюпо техинесой сущности и достигае:ому результату янляется способ культивцрованця гибридом на питательной среде Л 11121 с добавлением эмбриональной сыворотки коров и человеческих эДотееиеельееых клеток или их клеточного супернатацта (11 ГСБ), Добавление в цетатегеьную среду для гибридом че.овеческих эндотелиальных клетоки:и их к.еточного супернатацта позволяет увегпчить период способности продуцировать антитела при непрерывЕеол культивировании гибридом на 3 - А недели (так, клон гибридомы, полученной пссле слияния человеческих лцмфоцитов и Бп 20 - Лд 14 миелоМ- ными клетками мышей, сохранял способность пролуциронать антитела при непрерывном культивировании его в питательцой среде, содержащей человеческие эндотелиальные клетки в течение 10 педель, в то время, как тот же клон, культивируемый без такой дсбанеи, сохранял способность продуцировать антитела только в течение 7 недель) 1.23. Недостаток известного способа состоит в том, что гибридомы сохраняют свою стабильность не более 12 недель. Кроме того, для его осуществления необходимы (кроме деЬицитной эмбриональной сыворотки коров) эндотелиальные челонеческие клетки, которые получают из пупочного канатика (вены) эмбриона человека. Это очень осложняет и удорожает осуществление способа и огранцчиваег его применение при Еруполеасштабесм культинировании.Целью изобретения является увел;тчение продолжительцости продуктивного периода синтеза антител гиб-.иламами, путем создания селективцого преимущества для антителопродуцирующих клеток,Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу культивирования гибридом на питательной средес добавлением сыворотки жигсттных. в качестве сыворотки животных исполь.зуют свиную сыворотку.Нестабильность гибридом, т.е. потеря ими способности Гроизводитьантитела, связана с общей тендецциейклеточных гибридов потерь хромосомыв процессе их культивирования. Так,для гибридомы мышь х мышь утратаклеткой хотя бы одной хромосомы цзтрех, в которых находятся все геныиммуноглобулинов у мышей, ведетк утрате этой клеткой признака ацтителообразования, а затем в процесседальнейшего культивирования веськлон теряет этот признак, посколькудля многих клонов гибридом селективное преимущество имеют клетки, утратившие способность образования антител . Таким образом, повысить сгабцльность гибридом можно лишь созданиемусловий, в которых бы селективнаепреимущество имели антителопроцуццрующие клетки, Взято 3 клона гибридом (мышь х мышь), полученных известным способом, которые культивировалц в среде ДГ 1 Е 11 с добавлением5%-ной свиной сыворотки и параллельно в этой же среде, но с добавлением 10%-ной эмбриональной сывороткикоров. Концентрации сывороток выбраны с таким расчетом, чтобы це быларазличий в скорости пролиферацции в конечном урожае клеток в 1 мл,Периодически проводили тестирование клеточных супернатантов для определения антителопродуцирующей способности клонов. Результаты этого продолжительного опыта (9 мес) показали,что; а) клоны гибридом различаютсяисходно по своей стабильности и продуктивности; б) из трех клонов дваклона потеряли антителопродуцирующуюспособность через 4-9 недель культивирования в,среде с эмбриональнойсывороткой коров; один из них прикультивировании в среде со свитойсывороткой сохранял исходную активность в течение всего опыта (т,е,9 мес), активность второго (Н 14)ЕЕ гЕ7 т НЕ и, т тгтВООЛЯЕЕт 1 Ч ПОЗрдсталя нд 3 порядка и остдвд:деД ВЫСотС ОЬ. г Гтс) Гт Етв .т С К О 11 Д ОП НЕТ ЯВ) ТРЕТт 1 Ц Клат ОКЯЗД.т 1 СЯ ИСХОПЦИ г ВЫСОтта 1" дбИЛттцт 11ВЫСОКОЯКТцттттымИ асттДВЯ,ЕЕСЕ ТД тС.1 ПРИ КУЛЬТИВЦРОВД"ттс тГта и тт Оттдцт ЕЬ 1 Об ЕИХ СЬВ ОНОт 01 с; Г ) НОзрсснЯя дктигтеОсть 1 цбрцдамь 1 П 14 бттлд в.сскостдбцттьнсй ц со 10 Х 1 дтт 5 Лтт "Ь В т 1 ЯЛТтЕй 1 Е 11 ттр 1 т К 11-Тцпировднтти в среде с добдвленцем кдк свиной, тдк ц эмбриональной сьтвсроткц, Тдк 1 м Обстдзом свитд 1 сетеварот 1 сд Саэиавт СЕЛЕКТИВНЫЕ ГЦ 1 ЕЦтиттЕЕСттна15 тля ЯЕЕТИТЕЛОПГтсд";ИтруО.НХ КЛЕтак,П р и к е р 1,. КултьгцтттрстпсццтеГибрцпсмь т 1 А 12.21.9.ЦЯ К ттцттт 111 РО-тати;Я;СЦе тттаОБДЛЕклетки гцс. рц:О.ты ПЕЛ 2,21,9 цацусн - 2 О е 10 Й путе 1 схнтяец 5 клеток селезеетки ме 1 ет .Г Иццт Ос НСиммуетттзттравсет1 тЫХ ФЯ ГОМ гт, С МЦЕ, О.ЕЫМИ МЫШЦЦЫЬНЕКЛЕТ:Самтт Нр 2/О - Лс /14 и ПОСЛЕду 1 Опего отбора гцбрцгцтсгс клона, обтта даотего спасасзиостыо Гтртсдуцттровдтьатетгцтела в фагу,1. Титр антителв суперцятаегг (т. е. ЯнтцтелоттротттуццруюЕую способность гцбридомы)определяли известным способом. Исходно ндя дцтцтелоцродуццрующая способ -ность гибрцгссмы 12.21.9 выраженаВ Еаг % ИняКтцВцраВаННОГО фдрд тти рдв:Еа 2,0 (фиг, 1, ".очка 2 нааси у), эта означает, что прц дсбдтз 5 Етттти ОПРЕ татОНИ.ГО 1 СОтттитаг ТВД СУ -Гтере.Я ТЯнта (,О, 3 мл) к апре 1 е,те Гц Омуесастцттеству фдговы;, дг:гттц (250 ч;тс -тттц) инактцвцруе гся 100% фаговых асстцц.СУсгОцзито 1 СКОДнтттх клеток гцбРЕЕДа.;, Нсе 12.21.9 рдзделцлц на две части.К:;етки каждой порции отмыли центрцсоугцттовян 11 е;1 (5 Г 1 ин, 1000 Об мтпт)в бессывОрОтсчн 011 среде Д 11 Еь 1 (средаД.1 Г.1 - извсстетая среда Игната, мсдифиицр Овдеитя я Да льо 0 кко) .Первую порциео клеток (5 10 кл)5поместили во флакон Карреля (с 1 60 мм),содержащий 10 мл среды ДНЕМ с добавлением 5%-ной свиной сыворотки,использовали свиную сыворотку, полученную от животных в возрасте8 мес, стерилизованную фильтрованием (фильтр МтЛттицор 0,22 и) и 55инактивированную нагреванием до 56 Св течение 30 мии. Свиную сывороткудобавляли в концентрации 5%, обеспечивающей такую же скорость пралиферации и конечный урожай клетокВ 1 МЛ Кякт - Ы Обо с )1 Ч)БЯЕ ) 1 С а г я коцептрагия эбри)ц: Бг 01 сыворот ки коров (обычцг) применяемая прц культивировяги)и иприго;,г) г Культ 1- Бировяли при обьггггьгх условгях) (-"37 С, содсржлцие СО, Б атмосферном Воздухе от 5 д 107) до образования моиаслоя (через 2-3 сут куль-. тивирования, й 1 10 с) и Вов пересевали в такой же прогОрци 1О Б процессе цепрерывгого культивирования гибргиомцого кпоцд е)хеге,гге)ьцо проверяли его яцтителопродуцирук)- щую способность, котя)рл)т г)1)ег)ставлена цд фиг., 1, кривая 1, Кдк Бицо з это к)ИБО 1) Куль гч Би)Бд це и бридомы Н) 1221,9 цд питательной среде с добдвггеицеы свинг)й сь.БооотКИ ПОЭБОЛЯЕТ СОХРДИТЬ ЕЕ ГСХОД 1 УЮ аитителопродуццрующуо способность нд протяжении (ио крдиией мере) 40 недель непрерывного культивирг)вдция.ДЛЯ СРЯБЦЕГИЯ ВТОР )Ю ПОР)иО КЛС- ток (5 1 О кл) гибр 1 цомь Н 7 12.21,9Выращивали пяя)глелцО ца такой же питательной среде 1 МЕМ с добавлением 102-иой 3 брОцяльной сьворотки коров, в таких же условиях и с такой же еженедельной проверкой аитителапродуцирующей способности иепрерыво 30 культивируемого клоня, Результаты, определегия аитителопродуцирующей способности гбридомы Н Л 12.21,9при ее непрерывном культивировании на питательной среде с добяв)тгегиег эмбриональной сывороткг коров представлечы иа фиг. 1 кривая 2-. Как Видно из:) той к 1)ивой к )ьтивировяиие гибридомы 1 о известному способупозволяет сохранить ее исходиую ацтителопродуцирующую способность только в течение 3 и:,)ель,. Уже через7 недель такого ку;ьтг)ровяии 51аитителопродуцирующая сггособностьуМЕНЬШИЛаСЬ В 10 рдэ (ТОтКЯ 1 ца45оси у), т.е, активность супериятаитавыраженная Б шоу; Х ицактивироваииогоФага Л рапид 1 то означает чтопри добдв)тенин 0,3:гл су)терцятаитдк 250 фяговым Ястггьдгг иияктивируется 0107. Фяговьгх частиц, а тег)ез 9 недельКЛЬТИВИРОТЯГИ 5 ЯитгТЕЛОт)ОУ)11) оО"ЩЯЯ ЯКТИВИОСТЬ ИСЧЕЗЯЕТ СОВСЕМ (ВЬГживает 100/ фдговых частиц),П р и м е т) 2., Культивирование гибридомы Н 1 15.36,г.ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВЯИИЯ ГСтОЛЬЗ ОВЯтИ);летки гиб)идоьгы Н Л Г-,36.0 получеипои кя ч оцисд вг, в ),гт,;,и ) е Титр антител в супернатанте,опре:еляли известным способом, Исходная дцтитегопродуцирующая способность г)брцдомы Н т 14,36.0 вьгражена в Код 7. иияктивироваицого Фага 3 и равна 2 (фиг. 2, точка 2 на оси у) .Суспеизию исходных клеток гибридомы Н 14.36.0 разделили на 2 части; к;гетки каждой порции отмывали центрифугировяцием в бессывороточной среде НгЩ и культивировали кажду порцию тдк же, как описано в примереЕженедельно огределяли антителопродуццрующую способность каждого от;енино культивируемого клона, График яитителопродуцирующей способности11)ридомг при непрерывном ее культивироидиии представлен на Фиг. 2. Как видно из этого графика, культивирование гибридомы Н 14.36.0 на питательной Среде с добавлением свиной сь:воротки - кривая 1 ие только позволяет сохранить исходную антителопродуцируоцую способность гибридомы Б течецие длительпого времени, но, в цдциом случае, и повысить еев 10000 ряз. Как видно из кривой 1, после 5 недель непрерывного культивирования гибридомы в присутствии свицоц сыворотки ее антителопродуцирующал способность стала возрастать ц на 7-й неделе увеличиласьБ 10000 раз На графике 2 это соотдетствует точке 6 иа оси у, это означает, что при добавлении 0,3 мл иераз Бепеццого супернатанта ииактивируется 10 Фаговьгх частиц, тогда как на 6чальный или исходный супернатант иняктивировал 10 Фаговых частиц,Определение антителопродуцирующей активности второй порции гибридомы Н )5 1.36,0 при непрерывном культивировании в присутствии эмбриональной сыворотки коров (Фиг. 2, кривая 2) показало, что в этом случае исходная активность сохранялась в течение не более 2 недель, и уже через 5 недель культивирования этот клон полностью потерял аитителопродуцирующую способТаким образом, предлагаемый способкультивирования гибридом в отличиеот известного позволяет увеличить продььгОКИТЕЛЬНОСТЬ ПродуКтИВНОГО ПЕрИОдасинтеза антител гибридомями в 10 рази уменьшить стоимость производстваантител,аказ 60 1303 Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул ная,18 Тираж 522 НИКЧИ Госудррствейного кпо делам изобретени 5, Москва, Ж, Раушска Подписмитета СССРи открытийнаб., д. 4/5