Способ разделения биополимеров

(меров, полученныйреакционной среды ль отделяют отэлюируют ниэкомолева о-иссл%. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЭОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ ОПИСАНИЕ ИЗОБР АВТОРСМОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(71) Волгоградский научи ецовательский противочумный институт(56) 1. Воробьев А, АВасильев Н. НКравченко А. Г. Анатоксины. М., 1965,с. 87-84,2. Й 1 сЬагд 5 оп 5.Н МоФС 1 е К,А.,Й 1 г 1 г 1 сай 1 оп апд ргорег 11 е 5 оГ рег 4 пеаЬ 1 ау Гасог стоега епегоох 1 пагою соар 1 ех апд 5 упйЬес 1 с вед 1 а.ОпГ, 015 1970, ч. 121, 5 орр 1.,р 73-79.3. Авторское свицетельство СССРМю 663405, кл. А 61 К 39/35, 1979.(54) (57) 1. СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯБИОПОЛИИЕРОВ, предусматривающийконтактирование разделяемой смеси биополимеров с полиакриламицным гелем иэлюцию низкомолекулярной фракции биополимеров, отлича юшийся тем,что, с целью повышения полноты разцеления и степени концентрирования фракций, разделяемую смесь биополимеровпредварительно вводят в контакт со смесью исходных акриламицных сомономеров,инициаторов полимеризации и органического растворителя и осуществляют полимериэацию геля в присутствии биополикуля рную фракцию.2, Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью сохранения нативности биополимеров, в качестве органического растворителя при синтезе геля используют н-гептан.3. Способ по пп, 1 и 2, о т л и ч аю щ и й с я тем, что в качестве смеси биополимеров используют фильтрат культуры Ч 1 Ьг 1 о СЬо 0 егае 569 В, соцержащий холероген и "0" холерный антиген и цля полимеризации используют смесь, содер жащую акриламицные сомономеры в количестве 7,5% при концентрации поперечно- с 2Щ сшивающего сомономера 25%.4. Способ по пп, 1 и 2, о т л и ч аю щ и й с я тем, что в качестве смеси биополимеров используют препарат аллер- Св гена-кокцидиоицина из Сосс 1 с 1 ойе 5 1 епйб 5 и цля полимеризации используют смесь, содержащую акриламицные сомономеры авй в количестве 15% при концентрации поперечносшиваюшего сомономера 25%.5.Способпопп. 1 и 2, отлича ю щ и й с я тем, что в качестве смеси биополимеров используют культуральный фильтрат РБЕОдогпопа 5 р 5 еодотаИе 1 и для полимеризации используют смесь,ОО содержащую акриламицные сомономеры в количестве 10% при концентрации поперечносшиваюшего сомономера 251035518Изобретение относится к медицине,а более конкретно к биохимическим методам исследования, и может быть иопользовано при разделении низкомолекулярных ивысокомолекулярных иммунологически активных веществ,Известны способы разделения соединений различной молекулярной массыпутем диализа через материалы с опре.деленным диаметром пор: целлофан, кол Олодиевая пленка 1 ,Однако этот способ продолжителенпо времени и требует подбора материала с опрецеленным размером пор в каждом конкретном случае, 15Наиболее близким к предлагаемомуявляется способ разделения биополимеров (например, холерогена) путем гельфильтрации через биогель Р(полиакриламидный гель), включающий нанесение разделяемой смеси на колонку с гелем и элюцию фракций. Для этого сухойпорошок геля (биогель, акрилекс, ультрагель и др.) заливают буферным раствороми оставляют набухать. Через сутки набухший гель промывают пять раз буфером, Предварительно смонтированнуюколонку. заполняют гелем и промываютбуфером в течение 12 ч, Исходный материал наносят на столбик геля и разделение биополимеров проводят при постоянной,скорости потока элюирующего раствора ирегистрации содержания биополимеров вэлюате, который собирают с помощью коллекторе отдельными фракциями одинаковогообьема. франции, содержащие один и тот жв35биополимер, объединяют и концентрируют, Весь процесс разделения занима-.ет 48-50 ч 12),Недостатки способа - неполное раэце 40ление из-юа огранйченного по размерампор набора выпускаемых гелей и значительное разведение материала в процессегель-фильтрации, что требует последующего концентрирования, Кроме того,45. воспроизводимые результаты разделениябиополимеров методом гель-фильтрациимогут быть получены лишь при наличииспециального автоматизированного оборудования и высококвалифицированногоперсонала, Метод гель-фильтрации тре 50бует значительного времени на подготов-у геля, приготовление колонки, нанесение образца, проведение элюции, сборфракций и их анализа.11 ель изобретения - повышение полно.ты разделения биополимеров и степениконцентрирования фракций, а также сох"ранение нативности биополимеров. Указанная цель, достигается тем, чтосогласно способу разделения биополимеров, предусматривающему контактирование разделяемой смеси биополимеров сполиакриламидным гелем и элюцию низкомолекулярной фракции биополимеров, разделяемую смесь биополимеров предварительно вводят в контакт со смесью исходных акриламидных сомономеров, инициаторов полимеризации и органическогорастворителя и осушествляют полимеризацию геля в присутствии биополимеров,полученный гель отделяют от реакционнойсреды и элюируют ниэкомолекулярнуюфракцию.При этом с целью сохранения нативности биополимеров в качестве органичеокого растворителя при синтезе геля" иопользуют нгептан.В качестве смеси биополимеров обычноиспользуют фильтрат культуры % Ьг 1 осйо 1 е"ае 569 В, содержаший холерогени "0" холерный антиген и для полимеризации используют смесь, содержащуюакриламидные сомономеры в количестве 7,5% при концентрации поперечносшивающего сомономера 25%.В качестве смеси биополимеров используют также препарат аллергенакокцидиоидина иэ Сосс 131 одеэ 1 вт 111 эи для полимеризаиии используют смесь,содержащую акриламидные сомономеры вколичестве 15% при койцентрации поперечносшивающего сомономера 25%.В качестве смеси биополимеров используют культуральный фильтратРэеодоттопс 5 раЕидоваИв 1 и для полимеризации используют смесь, содерФжашую акриламидные сомономеры в количестве 10% при концентрации поперечнасшивающего сомономера 25%,Биополимеры (обычно белково-липополисахаридной природы с различной молекулярной массой) включают в сетчатую структуру полиакриламидных гранул, а размеры пор геля подбирают в соответствии с молекулярной массой такимобразом, чтобы ниэкомолекулярные биополимеры могли элюироваться, а высокомолекулярные - оставаться внутри гранул.Ускорение разделения биополимеров происходит эа счет увеличения площади поверхности геля, т.е. при приготовлении сферических частиц полиакриламидного геляразмером 100-150 мкм. Улучшениеразделения достигается включениемразделяемого материала эа счет приготовления геля с заданным размером пор,что позволяет включать до 95+3% ио35 3 10355ходного материала, Процесс разделениязанимает 8-10 ч. Для приготовлениягранул геля, оцнороцных по размерам,процесс полимеризации проводят при по следовательном введении инициаторов:сначала персульфата аммония, затем М, И,1 Ч,й-тетраметилэтилендиамина, Сохранению нативности биополимеров в процессе приготовления гранул геля способствует применение в качестве органической среды Н-гептана.В результате разделения ниэкомолекулярные биополимеры находятся в элюате, а высокомолекулярные биополимерынаходятся В гранулах, которые в дальнейшем. используются в, качестве иммуносор.бентов цля ацсорбции. иммунных сывороток;П р и м е р 1. Разделение холерогена и "0 антигена Ч 1 Ьг 1 о сЬоРегае.В 9 мл раствора холерогена-сырца(фильтрат бульонной культуры Ч, сто Решая 5699 В с содержанием белкадо 2 мгIмл) растворяют навески сомономеров; акриламица 1,5 г и М, Мметилепебисакриламица 0,5 г. Обшая концентрация геля 7,5%, концентрация поперечносшивающего сомономера по отношениюк общей 25%, Катализатор - 100 мгперсульфата аммония - растворяют отдельно в 1 мл 0,1 М фосфатного буфеЗОра рН 7,2 с 0,15 М хлористым натрием.Оба раствора дегаэируют в вакууме 10 мин.В 100 мл Н -гептана растворяют 0,25 млэмульгатора СПЭН, смесь переносятв сосуд цля полимеризации и продуваютгазообразным азотом 5 мин,Эмульгирование воцной фазы в органической и последующую полимеризациюосушествляют в колбе при перемешиваниина электрической мешалке (300500 об/мин) в атмосфере азота. Вначале40в течение 1 мин перемешивают органическую фазу с эмульгатором, затем смешивают дегазированные водные растворы сомономеров и катализатора и, не45прекращая перемещивания органическойфазы, медленно выливают воцную фазув сосуд цля полимеризации, После дву:минутного перемешивания к образовав-шейся эмульсии "воцы в масле" добав,ляют 100 мкл й, М, й, й- тетраметилэти.лендиамина (ТЭМЭД). Полимеризация происходит в течение 15-20 мин, об ее завершении суцят по резкому помутнениюэмульсии и обнаружению при световоймикроскопии желтоватьи сферическихчастиц диаметром 150-200 мкм. Образовавшуюся взвесь гранул отделяют оторганической фазы холероген элюируют 18 4буфером в течение суток при перемешива 4 нии, Холероген характеризуют по содержанию белка и углевоцов, а также по биологической и серологической активности.В табл. 1 представлена характеристика холе рогена исходного фильтрата, полу. ченного по предлагаемому способу и прототипу.Как следует из табл. 1, предлагаемый способ в отличие от прототипа позволяет разцелить хопероген (М М 84000 а.е,) и фО" антиген (М М 100000-300 ОООа.е,) что поцтверждено результатами реакций непрямой гемагглютинации с "0"-холерной агглютинирующей сывороткой и преципитации в геле.П р и м е р 2, Раэцеление аллергена и высокомолекулярного полисахарида возбудителя кокцидиоицоэа.Аллерген - кокцидиоидин (25 мг препарата антигена), полученный из Сосс- д 1 о 1 деэ цющ 1 5 36-Сильвейра известным способом (.33, растворяют в 5 мл буфера и готовят ПААГ-гранулы по вышеописанной метоцике, Концентрации геля составляет: общая 15%, поперечиосшиваю щего сомономера 25%. Аллерген характе ризуют по соцержанию белка и углевоцов, а также по биологической и иммунохимической активности.В табл. 2 дана характеристика аллергена-кокцидиоицина исходного, полученного предлагаемым способом и прототипу еКак следует из табл. 2, предлагаемый способ в отличие от прототипа позволяет разделить аллерген (М М 12000- 20000 а.е.) и высокомолекулярный полисахарид (М М 60000-400000 а,е.), что поцтвержцено результатами реакции иммунодиффузии в геле.П р и м е р 3 . Разцеление токсина и термостабильного гликопротеидного антигена возбудителя мелиоицоза.В ПААГ гранулы включают культураль ный фильтрат РЭеодооооая рэеидопщИе 1 (1,2 мг белка в мл). Концентрация геля составляет: общая 10%, поперечносшиваюшего сомономера 25%. Раэцеление токсина провоцят по описанной выше методике, Токсин характеризуют по содержанию белка и углевоцов, а также по биологи ческой и иммунохимической активности.В табл. 3 дана характеристика термолабильного мелиоицоэного токсина исходного, полученного по предлагаемому .способу и прототипу.Реакция непрямой гемагглютинациис 0" холерным антиКоличество линий в реакции имму нодиффузии в геле Белок, мг/мл Углеводы,мг/млИсходныйфильтратМ,сЪо 1 е-це5 1:10241 0,9 1,25 1;256 Предлагаемыйалюат 0,86 0,1 10 1 ф 512 нет Известный элюат после гель.фильт- рации 40 1 ф 64 0,18 0,1 14 Таблица 2 Количестволиний Активность в кожной пробе (размер эритемы,мм) Материал о Обьем способу млУглевоцы, Белок, мг/мм мг/мл преципитации в реакции иммунодиффузии в геле с иммунной сывороткой Исходный алле рген- кокцидиои- дин 0,5 0,88 Предлагамый элюат 0,135 0,15 О 9,0 Известный элюат и ле гель- фильтрации 60 2,0 0,04 Оу 07 3 10355Как следует из табл. 3, .предлагаемый способ в отличие от прототипа позволяет разделить мелиоидозный токсин (М М ЗОООО а.е.) и термостабильный антиген ( М М ) 50000 а.е.), что под тверкдено результатами реакции иммуно диффузии в геле,Изобретение по сравнению с известным способом позволяет более эффективно разделять биополимеры вслецствие полного (до 95%) включения внутрь геля. исхоцного материала, возможности приготовления геля с заданными размерами Активность в кожной пробе (титр) при ввецении,1 мл пор, что обеспечивает иммобилизациювысокомолекулярных примесей и элюциюинтересуюших биополимеров, проведенияэлюции небольшими обьемами, что сни-,жает степень разбавления полученныхпрепаратов и позволяет отказаться отпоследующего концентрирования, значительного сокращения (в 4-5 раз) времениразделения биополиме ров.Для проведения разделения биополимеров предлагаемым способом не требуется сложной аппаратуры и высококвалифицированного персонала,Таблица 1,19 131 0,0 0 Составитель О. Скородумоваецактор В. Ковтун Техрец Т,Фанта Корректор А. Повх Зак илиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная Известныйэлюат послегель-фильтрации 5824/45 ТиражВНИИПИ Госуцарстпо целам изоб 113035, Москва, Ж873 Поцписнвенного комитета СССРретений и открытий , Раушская наб., д. 4/5