Способ регенерации растений клевера in viтrо

Союз Советских Социалистических Республик(51)М, К .з2929693/3 1 6 7/О ийоарстаенный коинтеСССРедаи изобретенийи открытий осул(23) Приоритет 5,12.81, Бюллетень йо ия описания 15.12.81 публиковано ата опублико 53) УДК 581.14(72) Авторы изобретен езенцев и Л,вина замени научно.Р. Вильяма Всес иссл 71) Заявитель ный ордена Трудвательский инст Краскормо го им(54) СПОСОБ РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИЙ КЛЕВЕРА ребованиями кажк условиям, споации. Кроме тосов из проросткосходных форм иелекционного масо специфдого видасобствующго, получприводитзатрудняетериала. тй ческимирастенм регение калпотероценк е ераци аллус об реген ого из к из листо зованных Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано в селекции и семеноводстве растений, в частности в селекции на клеточном уровне и для ускоренного размножения и оздоровления селекционного материала, в исследованиях по фитопатологии, Физиологии и генетике растений.Известны способы регенерации растений из клеток суспензионных культур клевера белого (Тг 1 йобхшп герепз Ь.) и люцерны (наиболее близкого к клеверу рода семейства бобовых).В соответствии с этими способами 15 регенерацию растений осуществляют посредством получения каллусов из проростков клевера белого и листьев люцерны на агаризованных питательных средах с последующей дезинтеграцией 20 каллусной ткани на клетки и клеточные агрегаты в жидких питательных средах, размножения образовавшихся клеточных популяций и формирования дифференцированных структур (почки, эмбриоиды), а затем растений-регенерантов 1 и - 2.Однако эти способы оказались неприемлемыми для клевера лугового (Тг 1 йо 11 цт ргаепзе 1. ), что связано 30 Известен также снос и растений клевера луговной ткани, полученной вых эксплантатов, на агари питательных средах 3.Однако этот способ неприменим для клеточной селекции и не позволяет получать большое число регенерантов в расчете на 1 эксплантат (в среднем получают 25 растений).Целью изобретения является увеличение выхода регенерантов.Поставленная цель достигается тем, что каллусы получают из листьев посредством культивирования эксплантатов на модифицированной агаризованной среде В, в которую дополнительно вводят итаконовую кислоту, каллусную,ткань помещают в жидкую среду В 5 с кинетином и повышенной концентрацией тиамина - НС 6, а образовавшиеся клеточные суспензии куль.люминесцентном освещении 8-10 тыс,лки при фотопериоде 16 ч/сут темпеоратуре 221 С и относительной влажности воздуха 80+10 до образованиярастений с 6-7 листьями. Часть тройчатых листьев используют для получения каллусов, а растения с оставшимися 2-3 листьями высаживают в почву.На листочках, предназначенных 10 для получения каллусов, делают ряднадрезов вдоль жилок, помещают напитательную среду В , в которуюдополнительно вводят 6000-8000 мг/лагар - агара или бактоагара, 200300 мг/л нитрата аммония и 2-4 мг/литаконовой. кислоты, содержание сахарозы увеличивают до 2500030000 мг/л, железа (Т 1) сернокислого (ГеБО 4 7 НО) до 70-100 мг/л,трилона Б (ИаЭДТМ до 90-130 мг/ли вносят следующие фитогормоны:2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту(2,4-Д) 5-6 мг/л, кинетин 6-10 мг/ли с-нафтилуксусную кислоту (НУК)0,1-0,5 мг/л, рН среди доводят до 25 .5,8-6,0.Состав среды В (ОащЬогд е 1 аЕ1968) при РН 5,5 представлен втабл. 1. Таблица 1 Витамины, мг/л Сахароза,мг/л.10 КБО Тиамин - НСГ 10 150 Н ВО БаН РО Н О(ИН ) БОМдБОд 7 Н ОСаС 2 Н ОГеБО 7 Н ОК а ЭДТЛТрилон Б 134 Ба МоО; 2 Н 20 0,25 100 0,025 Миоинозит0,025 250 СиБО 4 5 НХО 150 СоС 2 . бН 20 28 К 1 37 ной ткани). Материал инкубируют навстряхивающих аппаратах с числомколебаний 100-125 мин упри освещенности 3-4 тыс. лк и температуре24+2 С. Через 8-10 суток суспензиисубкультивируют путем добавленияк 3-5 объемам свежей среды без гормонов 1-го объема суспензии, Через2-3 недели в суспензии образуютсяпроэмбриоиды (незрелые соматическиезародыши), которые пересаживают на 0 агаризованную среду 1/2 В без .гормонов. Через 8-10 суток из проэмбриоидов образуется эмбриогенная ткань,которую пассируют на свежую сРедутого же состава. После 12-14 днейкультивирования масса переса кенной 1.ивируют в жидкой среде В без горЯмонов, сформировавшиеся в суспензийпроэмбриоиды культивируют на агаризованной среде В 5 без гормонов до.образованияэмбриогенной ткани,проростков и растений-регенерантов.Причем итаконовую кислоту вводятв агаризованную модифицированнуюсреду Гамборга В в количестве2-4 мг/л,Содержание тиамина - НСВ в жидкойсреде Гамборга В составляет 2025 мг/л.Количество кинетина в жидкойсреде Гамборга В составляет 0,20,8 мг/л,Способ осуществляется следующимобразом.Семена культивируемых ортов игибридов клевера лугового обрабатывают 30 мин в концентрированной серной кислоте (скарификация и стерилизация), затем промывают стерильнойдистиллированной водой до нейтральной реакции и выдерживают в течение20-28 ч в темноте при 22+1 фС. Наклюнувшиеся семена помещают на агаризованную среду В 5 с уменьшенной вдвоеконцентрацией всех входящих в неекомпонентов (1/2 В 5) и инкубируютв закрытых прозрачйых сосудах при Материал инкубируют 12-14 дней при непрерывном освещении люминесцентными лампами (освещенность 8,0- 10,0 тыслк), температуре 22+1 С и относительной влажности воздуха 95 г.5,В случае появления на листочках бактериальной или грибной инфекции их удаляют с частью прилегающей к ним питательной среды.Образовавшиеся каллусы используют для получения клеточных суспензий, помещая их в жидкую питательную среду )35. с 0,2-0,8 мг/л кинетина и 20-25 мг/л тиамина - НС 6, (на каждый мл среды вносят 15-25 мг каллусНикотиновая кислота 1 Пиридоксин - НСВ 1888861 ткани увеличивается в 14-16 раз, и в ней развиваются проростки, которые через 2-3 недели образуют растениярегенеранты. Разросшуюся эмбриогенную ткань субкультивируют с 10-12- дневным интервалом с целью получения новых проростков. В конце каждого цикла выращивания образовавшиеся проростки переносят на агаризованную среду 1/2 В без гормонов. Через 2-3 недели из проростков Формируются растения-регенеранты с 4-5 листьями и корнями. Регенеранты пересаживают в почву и выращивают 14-16 дней под прозрачной синтетической пленкой (для предотвращения десикации), а затем в обычных условиях. 15П р и м е р. Проводили регенерацию растений из клеток суспензионТаблица 2 Отношение среднихмасс каллус/эксплан.тат Процентэксплантатов,образовавшихкаллусы Исходный материал Средняя масса Одногоэксплантата(листочка) одного каллуса Без ита- С итаконоконовой Вой кисло- кислоты той(3 мг/л) Без итако- С итаконовой кис- новой лоты кислотой(3 мг/л) 80 Листья растений 53,0 6,45+0,14 342 х 24 с 4 530+10,0 82,2 Листья регенерантов (листья взяты с регенерантов перед высадкой в почву) 91,7 Зс 60+Ос 17 180+17 сб 330+18 с 7 50,0 98 эмбриогенную ткань. В этой ткани через 2 недели сформировались проростки, а затем растения-регенеранты. Разросшуюся эмбриогенную ткань пересаживают с 10 дневным интервалом на свежую среду 1/2 В. Вконце каждого цикла выращивания в ткани Формируются новые проростки (по 150 шт на 500 мг пересаженной ткани), которые переносят на среду того же состава, Через 2 недели проростки образуют растения-регенеранты с 4-5 листьями и корнями. Последние высаживают в почву и выращивают 2 55 недели под полиэтиленовой пленкой,а затем в обычных условиях. Полученные растения-регенеранты свободны от Фитопатогенной инфекции, нормально ростут и развиваются, цветут и завязывают семена. Весь процесс регенерации от получения каллусов до высадки растений-регенерантог в почву занимает в среднеи три месяца. Выход регенерантов в расчете на 1 эксплантат (листочек) составРазность между вариантами с итаконовой кислотой и контролем без итаконовой кислоты достоверна при Р0,01.Полученные каллусы помещают в жидкую питательную среду с 0,5 мг/л кинетина и 20 мг/л тиамина из расчета 20 мг ткани на 1 мл среды и инкубируют на аппарате АВУ(аппарат универсальный для встряхивания жидкости в колбах и пробирках) при 100-125 колебаниях в минуту и амплитуде колебаний 20-30 мм. В течение 8-10 дней из каллусов образуются суспензии, содержащие в среднем 300 тыс. клеток/мл. Для получения проэмбриоидов из клеток суспензионных культур к 4 объемам свежей среды без гормонов добавляли 1 объем суспензии. Через 2 недели в суспензии сформировались зеленые проэмбриоиды (10 штук в каждом мл среды), которые после пересад ки на среду без гормонов образовали ных культур клевера лугового сорта ВИК. При этом получены следующие результаты: 80 листовых эксппантатов на среде с тремя фитогормонами: 5 мг/л 2 с 4-Д + 8 мг/л кинетина + 0,5 мг/л НУК и итаконовой кисло" той (3 мг/л) через 2 недели образуют каллусы со средней массой 530+10 мг. Итаконовая кислота (ненасыщенная двухосновная карбоновая кислота НООС-СН СООН является продуктом2 1снобмена веществ некоторых плесневых грибов, например Азрег 91 Юидф Ыасоп 1- спзс в культуре тканей используется впервые) стимулирует интенсивное развитие каллусов у растений сорта ВИКи у полученных из этого сорта регенерантов (табл. 2).888861 Формула изобретения Составитель Г. БростюкРедактор Л. Плисак Техред А.Ач Корректор Г. Огар Заказ 10789/2 Тираж 703 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, 3-35, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП ф 1 Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ляет: без субкультивирования эмбриогенной ткани - 7 тыс. растений, а при 2-кратном субкультивировании - 1 млн.Использование изобретения позволяет быстро размножать и оздоравливать селекционный материал, обра батывать мутагенами многочисленные клеточные популяции и проводить эффективный отбор ценных генотипов методами клеточной селекции, получая иэ отобраннЫх форм растения-регене" ранты. 1. Способ регенерации растений клевера 1 п ч 11 го, включающий получение каллусов на агаризованной питательной среде с последующей пересадкой их в жидкую питательную среду для выращивания клеточных суспен-. зий с последующим получением из них дифференцированных структур и расте ний - регенерантов, о т л и ч а ю" щ и й с я тем, что, с целью увеличения выхода регенерантов, в качест ве агаризованной питательной среды используют модифицированную среду Гамборга В с итаконовой кислотой, образовавшйеся каллусы переносят в жидкую среду Гамборга В с повышенной концентрацией тиамина - НС 8, в которую в качестве фитогормона вводят кинетин, полученные клеточныесуспенэин пересаживают в жидкую средуГамборга В без гормонов, а образовавшиеся иэ клеток лроэмбриоидывыращивают на агариэованной средеГамборга В беэ гормонов с регулярным субкультивированнем образовавшейся нз них амбриогенной ткани и пере 4садкой сформировавшихся в этой тканипроростков на среду Гамборга В безгормонов."О 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что итаконовую кислоту вводят в агаризованную модифицированную среду Гамборга В в количестве 2-4 мг/л.15 3. Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что содержание тиамина-НСВ в жидкой среде Гамборга Всоставляет 20-25 мг/л.4. Способ по п. 1, о т л и ч а ю- Щ щ и й с я тем, что количество кинетина в жидкой среде Гамборга Всоставляет 0,2-0,8 мг/л.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Т.Н. ОвхаИ е аЕ, СаЕЕцэ апдр 8 ап 10 е 1 гедепегаЫоп Егою сеМсиИшез оК 1 ад 1 по лЯочег апд эоуЬеап; РЬуэ 1 оС, РСап 1, р. 39, 129134, 1977.2. Авторское свидетельство СССРР 721036, кл. А 01 Н 3/00, 1978.3Авторское свидетельство СССР9 721035, кл. А 01 Н 3/00, 1978