Способ получения -гомосерина

О П И С А Н И Е (и 840107ИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскнкСоциалистическмк(6 ) Дополнительное к авт. сеид-ву -5 (22) Заявлено 04.04.78 (2 ) 2601783/28-13 (51) М, КЛ,. С 12 Р 13/06 с присоединением заявки нй -Государственный комитетпо делам изооретеиий и открытийОпубликовано 23,06,81. Бюллетень,% 2 Дата опубликования описания 25.06.81 3, М. Зайцева, И. Д. Мургов (НРБ),Л. А. Музыченко, Н. И. Жданова, И. Б. Б. Васильев, А. М. Лужков, В, С. Г. А. Великжанина и В. У, С. И, Алиханян,К. Черемухин,Роговер, Н. К. Краева,Рошаль(72) Авторы изобретения Всесоюзный научно-исследовательский институтгенетики и селекции промышленных микроорганизмов(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 1, -ГОМОСЕРИНА Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения Ь-гомосерина, являющегося промежуточным продуктом биосинтеза метионина, треонина и изолейцина5 во всех живых организмах и используемого в парфюмерной промышленности в качестве важного компонента косметических кремов для увлажнения кожи.Известен способ получения Ь -гомосерина с использованием треонинзависимого мутанта ЬудгосогЪосг,цМо 8, утилизируюшего углеводороды С - С в присутствииИ Мнеобходимых ростовых факторов (треоиин, биотин, тиамин) и солей (фосфора, магния, . микроэлементов), В культуральной жидкости накапливается до 6,5 г/л гомо. серина 1 .Недостаток указанного микробиологического способа получения (, -гомосерина заключается в том, что при осушествлении его микроорганизмы вырашивают на питательных средах с чистыми сахарами (глюкоза, мапьтоза), а в качестве источ 2ника ростовых факторов используют либо чистые аминокислоты (треонин) и витамины (биотин, тиамин), либо содержашие их дорогостоящие и дефицитные препараты, например экстракт печени.Известен также способ получения 4 - гомосерина путем глубинного культивирования продуцируюших его треонинзависимых микроорганизмов вида ВгеЧтЬОСт,е - тчцти Исчцаили Со уиеЬасАет.тцти фЖопттетти в условиях аэрации на питательной среде, содержащей ассимилируемые: источники углерода, минеральный азот и другие необходимые соли в присутствии источника ростовых вешеств. Используемые щтаммы по этому способу вырвшигвают в колбах на качалке на питательнсй среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу или мальтозу, а в качестве источников ростовых факторов - экстракт печени, 1 е 7 -амин или чистые аминокислоты (треонин) и витамины (биотин).а синтетической питательйой, среде с чистыми препаратами треонина и биотина макембв 1 сцм49-7 арактерис Кле длиной 1,0-2,0 м ожительные, альные бесспоровые, гнеподвижные,Мясо-пептонный агар (МПА та при 28 СО пятые сут коло лые нии диаметр с гладкими поднят, по краю складка, поверхн щая, цвет кремо ом 3 - 4 см, круг краем, центр прй- концентрическая ая, бле ос вый. а репная,а вторые сутый, поверхнос ост штриха у блестящая, пл т по уколу умеренныйновном на поверхносты. 3 8401 симальный уровень накопления гомосери- на составляет - 12,4 г/л, на полусиитетической (с применением экстракта печени и МХ -амина) - 7,3 г/л.Полученный гомосерин выделяют с помощью ионообменных смол. Выход продукта составляет 61 % 2.Недостатком способа является использование в качестве источников углерода чистых углеводов (глюкоза, мальтоза), 10 а в качестве источника ростовых факторов - дорогостоящих комплексных препаратов МХ -амина (фирменный препарат) и . экстракта печени.Цель изобретения - повышение рыхоца 15Ь-гомосерина.Поставленная цель постигается тем,. что в качестве треонинзависимых микро,организмов - процуцентов из вида Ь ЕЧ 1- ЬЮФ,ЕМОВВаЧОЮ ИСПОлЬЗуЮт ШтаМПВ 3 Е ч 1 ЬасАег 1 оп Ыачое В, или из вида СогмеЬас 1 е)-щв (6 Сат+КоМ штамм СогиеЬдс+егото ВоЫтоп ВНИИгенетика 49-7.При этом культивирование ведут на 25 питательной среце, содержащей в качестве ассимилиремых источников углерода мелассу, гидрол, сахар, ацетат или уксусную кислоту, а в качестве источника росрфология Клетки овальные, длиной 1,52,5 мк, бесспоровые, неподвижные, грамположительные. На пятые сутки роста при 28 С колонии диаметром 4 - 5 мм, круглые с гладким краем, центр припоцня в виде корпуса, поверхност гладкая, блестящая, цвет желтовато-кремовый. На вторые сутки рост штрих умеренный, край гладкий, поверхность блестящая, пло товых веществ используют кукурузный экстракт или гидролизаты растительного, животного или микробного белка, или авто- лизаты или гидролизаты дрожжей.В качестве штаммов-продуцентов применяются треонинзависимые мутанты В 3" Бачок В 1006 и Соиу 6 оФаиюсое ВНИИгенетика 49-7. В отличие от известных процуцентов предлагаемые культуры характеризуются способностью накапливать на синтетической среде до 20-21 г/л ( -гомосерина,Культуры хранятся в музее промышленных культур микроорганизмов ВНИИгенетика и имеют регистрационный номер.1006 и 1505, соответственно.Мутант Вг.ИаЧУЯ Вполучен из штамма дикого типа Вг ИачцеАТСС 14067 в результате комбинированного воздействия цвух мутагенов - Уф-лучей и этиленимина (ЭИ), мутант СОГДСОФам 1 сд 3 Ф ВНИИгенетика 49-7 - из штамма дикого типа СОГ Е 1 АОФ 1 СОФАТСС 13032 в результате воздействия химического мутагена - нитрозогуанидина.Культурально-морфологическая характеристика штаммов-продуцентов , -гомосерина приведена, в таблице,Рост по укочу умеренный, в основном на поверхности среды.840107 Продолжение таблицы Штамм Минеральнаясреда Гловерас глюкозой Для роста необходим биотин,тиамин, и треонин, На пятыесутки роста колонии диамет-ром 2,0-2,5 мм светлокремс.вого цвета Рост штриха на3-е сутки умеренный, плотный,ффизиол огические свойства Температура: растут при 2037 С, оптимум 28-30 С,рН; растет при 6 - 9, оптимум 7,0-8,0. Углеводы: хорошо утилизируют глюкозуфруктозу, сахарозу, мвльтозу,маннозу, хуже галактозу, неиспользуют лактозу не гидролиэуют крахмал.Спирты; используют этанол,инозит, используют, но неутилиэируют сорбит, маннит,дульцит, глицерин. Органические кислоты: хорошоиспользуют уксусную кислоту,хуже молочную,Источники азота: хорошоусваивают аммоннйный азот.,например соли аммония, хлористого, серрнокислого, вэотйокислого и др., мочевинусоли фосфора, например фосфаты калия,аммония, и др., соли магния, напримерсульфаты, хлориды и др., источники ростовых факторов, например гидролизаты,кислотные или ферментативные микробного (собственная биомасса) или дрожжевсго белка, полученного на углеводородахнефти БВК или древесных гидролиэвтах,Ха и ВГЕЧ 1 ЪОССЕт 1 МУП БЦЧИЮВДля осуществления процесса биосинте 45 за гомосеринв культуру микроорганизма выращивают на агвризоввнной питательной среде Хоттингерв в течение одной сутки при 28-30 С. Затем суспензию клеток передают в колбы с посевной средой, содержащей мелассу 4%, кукурузный экстравт 3% и ЙаС 6 0,4%, и проводят выращивание нв качалках (220 об/мин) в течение су ток, Выросший посевной материал передают в количестве 3-10% в основную ферментвционную среду. Процесс ферментвции осуществляют либо в колбах на качалке, либо в ферментере, обьемом 0,5- 10000 тыс,л. при интенсивном перемеши С,огюеЬлсФ,енот р ЬАОесап В НИИгенетика 49-7 Для роста необходим биотин и треонин. Нв пятые сутки колонии диаметрром 1,0-2,0 мм светло-кремовогоцвета. Рост штриха на вторые суткиумеренный, плотный. Температура растут при 20-37 фС,ооптимум 28-30 С, рн: растет при 6 - О, оптимум 7,0-8,0. Углеводы; хорошо утилйзируют глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтоэу, хуже галактозу, ксилоэу, маннозу, не используют лактозу, не гидролизуот крахмал . Спирты: слабо утилизируют этанол,не используют глицерин, дульцит,м винит. Органические кислоты: хорошо используют уксусную и молочнуюкислоты, хуже фумвровую, янтарную,пировиногра дную. Источники азота: хорошо усваиваютвммонийный азот, мочевину, неусваивают нитрвтный азот. Обладает уреазной активностью. Желатину не разжижают..ся подача подпитки, осуществляемая автоматически по сигналу рН-датчика.Состав используемой подпитки,%: Ацетат 13,5Ацетат 46,5Через 72 ч ферментации расходуется 118 мл подпитки. В культуральчой жидкости накапливается 12,6 г/л Ь-гомосерина и 11,5 г/л Ь-лизина.Таким образом, как показано в примерах, предлагаемый способ позволяет получить Ь -гомосерин как на синтетических, так и на комплексных питательных средах, т.е. на средах, содержащих различные источники углерода и доступное и дешевое техническое сырье. Предлагаемые новые штаммы-продуценты гомосе ина синтезировать до 20 г/л продукта,Способ рекомендован к внедрению ьа предприятиях микробиологической промыш ленности для производства Ь -гомосерина .в кристаллической форме или в форме . технического препарата (концентрата). формула изобрете ни я 1. Способ получения Ь -гомосерина путем глубинйого культивирования пропу цирующих его треонинзависимых микро-, организмов вида В Вч 1 Ъос 16 Йщи Яочцв или СогоеЪасег 1 ов цЕо 1 атсое 12в условиях аэрации на питательной среде,содержащей ассимилируемые источникиуглерода, минеральный азот и рругиенеобходимые соли в присутствии источников ростовых веществ., о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что, с целью повышениявыхода Ь-гомосерина, в качестве треонинзависимых микроорганизмов продуцентовиз вида ВЖч 1 ЬасФЕИОв НОМОМ исполь 10 зуют штамм Вгеаоостемцю ИачопВ, или из вида СОгзиеЪОс+егавм дбАа.;Чсов штамм СогзеЪаОег 1 цв гбоМв 1 сов ВНИИгенетика 49-7,2. Способ по и. 1, о т л и ч а ю -15 щ и й с я тем, что культивирование ведут на питательной среде, содержащейв качестве ассимилируемых источников .углерода мелассу, гидрол, сахар, ацетатили уксусную кислоту, акачестве источ 20 ника ростовых веществ используют кукурузныйзкстракт нпи гидролизаты растительного, животного или микробного белка, или автолизаты или гидролизатыдрожжей.25 Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Патент франции1581254,кл. С 12 О, опублик. 1965.2. Патент франции1306015кл, С 12 Э, опублик. 1965.Составитель М. ЛаринаРедактор О, Черниченко Техред А, Ач Корректор М. ШарошиЭщфЗаказ 4664/33Тираж 528 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж 35, Раушская наб., и. 4/5