Способ количественного определения нукле-озид-5 монофосфатов

Союз Советских Социалистических РеспубликОПИСАНИЕ цИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИ ИТИЛЬСТВУ(61) Дополнительное (22) Заявлено 3 1.1 0 9 исоед ением затет и 01 й 31/16 осударствеиный ком СССР яо делам изобретен и открытий(2 ор Опубликовано 3005.81, Бю ень ЙВ 23 0.0 5.8 1 3) УДК 543. 242 . 3 (088. 8) Дата ликованияописан(5 ПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ НУКЛЕОЗИД-МОНОФОСФАТОВ ектатесфатИзобретение относится к аналитической химии, а именно к способам количественного определения нуклеоэид- -5" -монофосфатов, которые имеют большое значение в медицине, биохимии и молекулярной биологии.Известен способ количественного определения нуклеозид-монофосфа" тов, основанный на способности оснований нуклеиновых кислот поглощать ультрафиолетовые лучи в области 240- 290 нм п 11.Недостатком этого способа является низкая .избирательность, поскольку невозможно определять нуклеоэид -5 -монофосфаты в присутствии деэоксирибонуклеозид-монофосфатов и нуклеозид(3)-монофосфатов.Наиболее близким к предлагаемомупо технической сущности и достигаемо му результату является сПособ количественного определения нуклеозид- -5 -монофосфатов, заключающийся в последовательной обработке анализируемой пробы раствором периодата нат рия, раствором молибдата натрия при рН среды 2,9-3,1, раствором иодида калия с последующим титрованием полученного раствора тиосульфатом натрия в присутствии крахмала 2 . 30. свид-ву -21) 2834315/26-04 (51)М Недостатком этого способа является низкая чувствительность определения, т.е. для проведения анализатребуется 35-40 мг анализируемоговещества,Цель изобретения - повышение чувствительности определения.Поставленная цель достигается темчто в способе количественного определения нуклеоэид-монофосфатов, заключающимся в обработке анализируемойпробы раствором периодата натрия,раствором молибдата натрия при рНсреды 2,9-3,1 и раствором иодида калия с последующим титрованием полученного раствора тиосульфатом натрия вприсутствии крахмала, полученный после обработки анализируемой пробы периодатомнатрия иуклеоэид-монофосфатдиальдегид обрабатывают метиламином или бутиламином при рН среды6,5-7,5 и температуре 35-40 фС примольном соотношении нуклеоэид-монофосфатдиальдегид : периодат натрия : метиламин или бутиламин, равном 1 г 10"15 т 160-800 соответственно.В присутствии первичных алифатических аминов положительный эффдостигается тем, что в результрасщепления нуклеоэид-монофодиальдегидов,образуются три дополнительных моль иодата, которые действием избытка иодида калия переводятсн в эквивалентное количество иода. В конечном определении это приводит к измерению 24 эквивалентов титранта на 1 моль определения вместо 6 эквивалентов в известном способе, что представляет собой повышение чувствительности и экономии анализируемого вещества в 4 раза. Для проведения анализа по предлагаемому способу необходимо 7-10 мг анализируемого вещества.Расщепление периодатом в присутствии первичных алифатических аминов протекает следующим образом.Сперва нуклеозид" -монофосфатдиальдегиды реагируют с 1 моль первичногоалифатического амина с образованием моноальдимина, который претерпевает внутримолекулярную конден сацию с образованием энамина. Последний образует четвертичное амониевое основание, которое быстро отщепляет фосфат, а после этого гидратация четвертичного аммониевого осно вания приводит к образованию другого энамина, который образует циклический эфир с периодатом. Гидролиз этого эфира приводит к образованию диода, который реагирует со вторым молем периодата с образованием карбоната гетероциклического основания, который при гидролизе образует промежуточный диол, реагирующий с третьим молем периодата.Положительный эффект заключается в повышении чувствительности способа в 4 раза, по сравнению с известным, вследствие образования 4 моль иодата в процессе окисления 1 моль нуклеозид"-монофосфата. 40Температура среды 35-40 С обеспечивает быстрое и количественное протекание. реакции расщепления нуклеозид- -5-монофосфатдиальдегидов,При более низких значениях температуры скорость 45 реакции расщепления замедляется - реакция протекает количественно лишь за 4-5.ч. При более высоких температурах заметно возрастает величина поправки расхода титранта в холостом опыте, что нежелательно при осуществлении аналитических определений,Увеличение значения рН также ускоряет реакцию расщепления нуклеозид ,-5 -монофосфатдиальдегидов периода- том. Оптимален интервал рН 6,5-7,5. Повышение кислотности среды замедляет скорость этой реакции, а понижение кислотности среды выше рН 7,5 приводит к заметному возрастанию величины поправки расхода титранта в Я холостом. опытеСоотношения нуклеозид-монофос 1Фатдиальдегид; периодат ; первич- ный алифатический амин 1 : 10 15 : 160 - 800 обеспечивают быстрое и количественное протекание реакции расщепления нуклеозид-монофосфатдиальдегидов. При более низких концентрациях периодата и первичного алифатического амина по существующей методике проведение эксперимента невозможно.Таким образом, предлагаемый способ заключается в следующем.Навеску определеяемого нуклеозид- -5 "монофосфата, величиной приьлизительно 25 мкмоль, растворяют в дистиллированной воде и окисляют 10- 15-кратным молярным избытком периодата натрия. Эатем в реакционную смесь вводят 160-800-кратное молярное количество первичного алифатического амина, нейтрализованное до рН 6,5- 7,5 и выдерживают в водяной бане при 35-40 С в течение 1-2 ч. По окончании реакции расщепления создают рН 3,0+0,2, замаскируют избыток периодата, а образовавшийся иодат избытком иодида калия превращают в эквивалентное количество иода, которое находят титрованием стандартным раствором тиосульфата натрия. Параллельно проводят холостой опыт (без навески нуклеозид-монофосфата) .Содержание основного вещества нуклеозид-монофосфатов вычисляют по формуле где Н - объем стандартного растворатиосульфата натрия, израс-.ходованный на титрование в .анализе, мл;Ч - объем стандартного раствора2тиосульфата натрия, израсходованный на титрование вхолостом опыте, мл;й - нормальность стандартногораствора тиосульфата натрия(обычно 0,0250 н,), г-экв/Л;И - молекулярная масса определя.емого нуклеозид-монофосфата;д - навеска определяемого вещества, мг,и - число моль периодата, реагирующих с 1 моль нуклеозид, -5 -монофосфата (и = 1 в известном и и щ 4 в предлагаемом способах).П р и м е р 1. Количественное определение аденозин-моноФосфорной кислоты (ЛИФ). И 347,23; рН 7 у 5; й 40 С.В коническую колбу емкостью 250 мл помещают навеску препарата, равную 8,68 мг и растворяют в 10 мп дистиллированной воды. К полученному раствору прибавляют 15 мл 0,025 М раствора периодата натрия в воде, перемешивают содержимое колбы и оставляют на 10 мин в защищенном от прямого солнечного света месте. Потом прибавляют 2 мл 4 М раствора гидрохлоридабутнламина, нейтрализованного дорН 7,5 0,1 М раствором МаОН (контроль рН осуществляют рН-метром) иреакционную смесь 1 ч выдерживаютв водяной бане при 40 С. Затем в колобу вносят 25 мл буФерного растворана 1 М раствора монохлоруксусной кислоты и МаОН с рН 3,0 и 8 мл 2 М раствора молибдата натрия и тщательно перемешивают ее содержимое. Наконец,прибавляют 5 мл 20-ного раствора иодида калия, перемешивают содержимоеколбы и через 2 мин выделившийся иодтитруют 0,0250 н. раствором тиосульФата натрия, К концу титрования прибавляют 2 капли 0,5-ного раствора 15крахмала и продолжают титровать доисчезновения сине-розовой окраскираствора. Расход титранта (Ч ) составляет 24,94 мл,Холостой опыт (без навески определяемого вещества) проводят аналогично. Расход титранта (Ч ) составляет 2,14 мл,По формуле (1) вычисляют содержание АМФ. 25Ф (24,94-2,14) 347 23 О 2508,6846ЗОх 100 = 95,0Определено 25 мкмоль АМФ с точностью 0,8.П р и м е р 2. Количественное определение цитидин-монофосфорной кислоты (ЦМФ). И 323,20; рН 7,0;35с 35 оСВ коническую колбу емкостью 250 мл помещают навеску препарата, равную 7,92 мг и растворяют в 5 мл дистиллированной воды. К полученному раст" 40 вору прибавляют 10 мл 0,025 М раствора периодата натрия в воде, перемешивают содержимое колбы и оставляют на 15 мин в защищенном от прямого солнечного света месте. Потом при бавляют 1 мл 4 М раствора гидрохлорида метиламина, нейтрализованного до рН 7,0 0,1 М раствором МаОН в воде (контроль рН осуществляют рЦ-метром) и реакционную смесь 1,5 ч выдерживают 50 в водяной бане при 35 дС. Затем в колбу вносят 20 мл буферного раствора из 1 М раствора монохлоруксусной кислоты и МаОН с рН 3,0 и 5 мл 2 М раствора молибдата натрия и тщательно перемешивают ее содержимое. Наконец, прибавляют 5 мл 20-.ного раствора иодида калия, перемешивают содержимое колбы и через 1 мин выделившийся иод титруют 0,0250 нраствором тиосульФата натрия. К концу титрова ния прибавляют 2 капли 0,5-ного раствора крахмала и продолжают титровать до исчезновения сине-розовой окраски раствора. Расход титранта (Ч., ) составляет 20,20 мл. Холостой опыт (беэ навески определяемого вещества) проводят аналогично. Расход титранта (Н) составляет 3,00,мл.По формуле (1) вычисляют содержание ЦМФ(20 20-3,00)323 200 02507,92 46У 100 : 79,.9Определено 24,5 мкмоль ЦМФ с точностью 0,6.П р и м е р 3. Количественноеопределение уридин-монойосфорнойкислоты динатриевой соли (УМФ.-МаОН),М 368,15; рН 6,5; с 37 С.В коническую колбу емкостью 250 млпомещают навеску препарата, равную9,20 мл и растворяют в 5 мп дистиллированной воды. К полученному раствору прибавляют 10 мл 0,025 М растворапериодата натрия в воде, перемешиваютсодержимое колбы и оставляют на15 мин .в защищенном от прямого солнечного света месте. Потом прибавляют 5 мл 4 М раствора гидрохлоридаметиламина, нейтрализованного дорН 6,5 0,1 М раствором МаОН (контроль рН осуществляют рН-метром) иреакционную смесь 2 ч выдерживают вводяной бане при 37 С. Затем в колбуовносят 20 мл буферного раствора из1 М раствора монохлоруксусной кислоты и МаОН с рН 3,1 и 5 мл 2 М раствора молибдата натрия и тщательно перемешивают ее содержимое. Наконец,прибавляют 5 мл 20-ного раствора иодида калия, перемешивают содержимоеколбы и через 3 мин выделившийся иодтитруют 0,0250 н. раствором тиосульфата натрия. К концу титрования прибавляют 4 капли 0,5-ного растворакрахмала и продолжают титровать доисчезновения сине-розовой окраскираствора. Расход титранта (Ч ) составляет 20,78 мл.Холостой опыт (без навески определяемого вещества) проводят аналогично. Расход титранта (Ч ) составляет 1,44 мл.По формуле (1) вычисляют содержание УМФ-Ма(20 78-1 44) 368,15 0,0250Ю,201 100 = 80,6Определено 25 мкмоль УМФ-МаО с точностью 0,5,Формула изобретенияСпособ количественного определения нуклеозид-монофосфатов путем обработки анализируемой пробы раствором периодата натрия, раствором834512 Составитель Л. СоломенцеваТехреду И. Асталош Корректор Р, Назарова Редактор О. Ковач Заказ 4039/бб Тираж 907 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, В, Раушская наб., д, 4/5а с е ю агавеФилиал ППП "Патентф, г. ужгород, ул. Проектная, 4 молибдата натрия при рН среды 2,9- 3,1 и раствором иодида калия с последуашнм титрованием полученного раствора тиосульфатом натрия в присутствии крахмала, о т л и ч а ю"щ и й с я тем, что с целью повышения чувствительности определения, полученный после обработки периодатом натрия нуклеоэид-монофосфатдиальдегид дополнительно обрабатывают метиламином или бутиламином при рН среды б,5- 1 7,5 и температуре 35-40 С при мольном соотношении нуклеоэид-монофосфатдиальдегид : периодат натрия : метил- амин или бутиламин, равном 1:10 - 15:160 - 800. Источники информации,принятые во внимание при экспертизеЮ1. Ультрамикроанализ нуклеиновыхкислот. Под ред. Д,П. Кнорре. М.,фНаукаф, 1973, с. 95-133. 2. Бусев А.И., Захаранс В.Я Иикстайс У.Я. Определение е,-гликольиой группировки в компонентах нуклеиновых кислот. 1. Новый амплификационный метод титриметрического определения рибонуклеозидов и нуклеозид- -5 -фосфатов. фХимико-фармацевтический журнал", 1977, Ф 3, с. 128-132 (прототип).