Способ определения патогенностинейссерий

) СПОСОБ ОПР ИЯ ПАТОГЕННОСТИ НЕЙССЕР Способ осуществляют следующим образом.Подготавливают куриные эмбрионы, дЛя заражения берут 9-11-дневные куриные эмбрионы, у которых искусственно перемещают воздушный мешок для заражения через щель в скорлупе на хорионаллантоисную оболочку (ХАО).Подготовка культуры нейссерий: 16-20 часовую культуру нейссерий с сывороточного агара смывают физиологическим раствором (рН 7,0-7,2) и готовят 2 млрд. микробную взвесь, соответствующую 20 ед. международного оптического стандарта мутности.Для заражения куриных эмбрионов 2 млрд, взвесь нейссериивводят на ХАО в объеме 0,1 мл таким образом, чтобы доза для одного эмбриона составила 200,млн, микробных тел. Это оптимальная доза инокулята, вызывающая различные степени тяжести пато- . логоанатомических изменений органов и тканей эмбрионов в зависимости о Изобре ской микр Извест генности куринных кубирован собности Однакомедицин тение относитсяобиологии.ен способ опреднейссерий путемэмбрионов с посием и определенэмбриона Г 11.известный спос о лени зараж едующим инем жизнеспонедо а-. вов 15 201 точно чувствителен.Цель изобретения - и ышение чу ствительности способа.,Эта цель достигается тем, что о ределяют патогенность нейссерий пу тем заражения куриных эмбрионов с последующим инкубированием и определением жизнеспособности эмбриона при этом эмбрион заражают. 2 ярд. микробной взвеси нейссерий по 0,1 на хорионаллантоисную оболочку и после инкубирования дополнительно определяют выраженность кровоизлияний ,отек мозга и других органов, пареэо конечностей, по которым характеризуют степень патогенности. олаева83 ч 122 3вирулентных свойств испытываемого штамма. Контрольной группе эмбрионов вводят по 0,1 мл стерильного фиэиоло гического раствора. Опытные и контрольные группы эмбрионов инкубируют 20-24 ч в условиях периодически вен. тилируемой камеры термостата при 37-38 С.Овоскопию проводят по общепринятой методике для определения жизнеспособ О ности эмбрионов.Определяют степень вирулентности исследуемого штамма нейссерий.Яйцо вскрывают с соблюдением правил асептики, определяют жизнеспособность эмбриона по его подвижности и сравнивают с результатами овоскопии. Затем стерильным шприцем отсасывают ликвор и кровь эмбриона для посева на сывороточный агар и приготовления маэ О ков для повышения достоверности диагностики. После этого вскрывают брюшную и грудную полости, отсепаровывают кожу на голове эмбриона для обнажения мягкой мозговой оболочки. 25Учитывают патологоанатомическую картину изменения органов и тканей: наличие тромбоза сосудов ХАО, кожных и мозговых кровоизлияний, спастически сокращенных мышц конечностей, отек ЗО головного мозга, гиперемию и отек печени и почек. для подтверждения специфичности развивающегося процесса, кроме высевов из ликвора и крови, можно сделать высевы из мозга, печени, сердца и почек.Степени вирулентности исследуемого штамма нейссерии определяют при сравнении патологоанатомических изменений органов и тканей опытных и контрольных эмбрионов.При вскрытии контрольные эмбрионы живые, с хорошо развитыми сосудами ХАО; кожные покровы и внутренние ор ганы без особенностей. При вскрытии опытных эмбрионов, зараженных нейссериями, вявляется одна из четырех форм (степеней)изменений 50 органов и тканей в зависимости от стеИпени выраженности признаков - бессимптомная", "легкая", "средняя" итяжелая"Бессимптомная" форма. Опытные эмбрионы по внешнему виду и состоянию органов не отличаются от контрольных эмбрионов, хотя в высевах типируются нейссерии."Легкая" форма. При вскрытии - живой эмбрион, сосуды ХАО без изменений, кожа светлая с единичными мелко- точечными кровоизлияниями, внутренние органы без изменений, однако на оболочках мозга единичные кровоизлияния,"Средняя" форма. При вскрытии - погибший эмбрион с тромбированными сосудами и капиллярами ХАО; на фоне гиперемированной кожи видна разнокалиберная сыпь, отмечается отек головного мозга, Определяемый по выбуханию полушарий мозга и вытеканию красновато-желтой мутной жидкости при прокалывании кожи и оболочек мозга бактериологической петлей, инъекция капилляров и кровоизлияния на оболочках мозга. Выраженные изменения паренхиматозных органов; резкое увеличение в размерах, отек, гиперемия печени и почек, Сердце останавливается в систоле желудочков, предсердия заполнены темной кровью, просвечивающей через ткани сердца."Тяжелая" форма. Погибший эмбрион резко отличается от контрольных как по размерам, так и по внешнему виду. Увеличение размеров эмбриона связано с резкий отеком тканей, головного мозга и внутренних органов, Кожа резко гиперемирована с цианотичным оттенком, кроме типичной сыпи отмечаются кровоизлияния по ходу крупных сосудов на шее и лапах. Типичные спастические сокращения конечностей (поджатые лапы со сведенными пальцами, не поддающимися разгибанию). Высоковирулентными счтают штаммы, дающие гибель эмбрионов с развитием "тяжелой" степени поражений органов и тканей. Умеренновирулентными - штаммы нейссерий, вызывающие гибель эмбрионов и "среднюю" степень их поражения.Слабовирулентными - штаммы, вызывающие "слабую" степень поражения эмбрионов. Авирулентными " штаммы, которые по результатам вскрытия, не зависимо от высева возбудителя и обнаружения его в мазках, не отличаются от контрольной группы эмбрионов.Пример оценки степени патогенности нейссерий на куриных эмбрионах при заражении эталонными штаммами.5 8341Непатогенный штаммнейссерий М.ЬОЬГ 1 аЬа 20 М,Непатогенный штамм .нейссерий К,Г 1 аЬа 65,Слабовирулентный5штамм менингококка; М 20.Высоковирулентныйштамм менингококка . У 1298.Штамм менингококка:У 1409/131.16-20 часовые культуры вышепереечисленных штаммов нейссерий смываютфизиологическим раствором с сывороточного агара и готовят 2 млрд. взвесь(20 Ед. по международному оптическому стандарту) и в объеме 0,1 мл вводят на ХАО 9-11-дневным куриным эмбри.оиамКонтрольным эмбрионам аналогичным методом вводят фйзиологическийраствор. Через 24 часа инкубации при37-38 С в термостате яйца овоскопи-. 2 роруют и вскрывают. Сравнивают жизнеспособность эмбрионов, установленнуюпри вскрытии яйца, с результатами овоскопии, делают высевы крови, ликвора,органов и мазки из ликвора, крови, 25затеи изучают степень патологоанатомических изменений органов и тканейэмбрионов.Результаты опытов. Контрольнаягруппа эмбрионов. 30При вскрытии все эмбрионы живые схорошо развитыми сосудами и капиллярами ХАО, которые заполнены светлой(артериальной) или(темной) венознойкровью. Кожные покровы и внутренние 55органы без особенностей,Штамм М,ЯОЬГ 1 аЬа 20 М. Овоскопия:все эмбрионы живые.Вскрытие эмбрионов: по внешнемувиду и состоянию органов и тканей они 4 Ене отличаются от контрольной группыэмбрионов. В высевах из крови, ликвора, внутренних органов и с оболочекмозга - М. 50 ЬГ 1 аЬа. 45Заключение; штамм авирулентный.Штамм М. ГаЬа 65. Овоскопия: один эмбрион погиб, остальные живые.Вскрытие эмбрионов:,а) живые эмбрионы по внешнему виду50 и состоянию органов не отличаются от контрольных эмбрионов, в высевах из тканей и жидкостей М,Г 1 аЬа.б) погибший плод - кожа светлая, . негиперемированиая, внутренние органы без особенностей, отсутствуют характерные признаки, наблюдаемые при заражении эмбрионов менингококковой культурой, такие, как полиморфные по 22 6техии, кровоизлияния по ходу крупных.сосудов, отек головного мозга, резкая гиперемия и отек паренхиматозныхорганов. Таким образом, у одного эмбриона неспецифическая гибель, а остальные не отличаются от контрольных эмбрионов, Заключение: штамм вирулентный,Штамм менингококка М. Овоскопия:все эмбрионы живые.Вскрытие эмбрионов: живые эмбрионы,сосуды ХАО без изменений, кожа светлая с единичными мелкоточечными кро-.воизлияниями, внутренние органы безособенностейоднако на оболочкахмозга единичные кровоизлияния. Посевы крови стерильны, а в мазках крови и ликвора обнаружены менингококки.Иэ посевов мозга, печени, почек, сердца на сывороточный агар выделеныменингококки. Таким образом, у эмбрионов "легкая" степень поражения органов,Заключение: штамм слабовирулентный.Свежевыделенный штамм менингококка В 1409/131.Овоскопия: жизнеспособность нескольких эмбрионов четко определитьне удалось,Вскрытие эмбрионов: погибшие эмбрионы с тромбированными сосудами и капиллярами ХАО, на фоне гиперемированной кожи видна разнокалибернаясыпь, отмечается отек головного мозга, определяемый по выбуханию полушарий мозга и вытеканию красноватожелтой мутной жидкости при прокалывании кожи и оболочек мозга бактериологической петлей, инъекция капиллярови кровоизлияния на оболочках мозга.Выраженные изменения паренхиматозных органов: резкое увеличение в размерах, отек, гиперемия печени и почек.Сердце останавливается в систолежелудочков, предсердия заполненытемной кровью, просвечивающей черезгкани сердца. Таким образом, у эмбрирнов "средняя" степень поражения органов и тканей, Заключение: штаммумеренновирулентный,Штамм менингококка , В 1298. Овос- копия: все эмбрионыпогибли.Вскрытие эмбрионовф погибшие эмбрионы резко отличаются от контрольных как по размерам, так и по внешнему виду. Увеличение размеров эмбрионов связано .с резким отеком тканей, головного мозга и внутренних органов. Кожа резко гиперемирована с цианотичным783412 оттенком, кроме типичной сыпи отмечаотся кровоизлияния по ходу крупных сосудов на шее и лапах, Типичны спастические сокращения конечностей (поджатые лапы со сведенными пальцами ),5 неподдаациеся разгибанию. Поражение эмбрконов "тяжелой" степени. ЗаключеНИе 1 высоковирулентный штамм.вышеизложенным способом удалось установить степень патогенности 39 свежевыделенных штаммов менингокок-.:. ков к уточнить ее у 55 эталонных штаммов нейссерий, из них 30 штаммов ме" нигококков и 25 штаммов непатогенных видов нейссерий.15Предложенный способ позволяет повысить чувствительность и специфичность по сравнению с известным способом, так как позволяет установить жизнеспособность эмбрионов. Кроме того, он в О раз экономичнее, поскольку для заражения эмбрионов ис.пользуют одну дозу вместо десяти. Формула изобретенияСпособ определения патогенности нейссерий путем заражения куриных эмбрионов с последующим инкубированием и определением жизнеспособности эмбриона, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, эмбрион заражают 2 млрд. микробной взвеси нейссерий по 0,1 мл на хорионаллантоисную оболочку и после инкубирования дополнительно определяют выраженность кровоизлияний, отек мозга и других органов, парезов конечностей, по которым характеризуют степень патогенности.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе:1. Касацкая Л.К. 0 токсичности ивирулентности менингококковых культур.Канд. дисс. 1975, с, 143, Составитель С. Малютина Редактор Е.Лушникова Техред А.Бабине Кор ектор Г. Решетник. ВНИИПИ Государственного комитета СССР . по делам изобретений и открытий 11 3035 Москва ЖРаушская наб, . 4/5 Филиал ППП "Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4