Способ определения активностинадни надфн-генерирующих дегидрогеназ

О П И С Д Н И Е, 1794071 Савв Советских Социалистических Республик(45) Дата опубликования описания 22,01.81(088,8) по делам изобретений и открытикИзобретение относится к биологии, медицине, микробиологии, промышленной биохимии, может быть использовано для определения активности различных НАДН- и НАДФН-генерирующих дегидрогеназ в спе циальных биохимических исследованиях, для,контроля технологических процессов (например, в ферментной и спиртовой промышленности), определения активности дегидрогеназ с диагностической целью в ме дицине и др.Известны способы определения дегидрогеназной активности с использован 1 ием хинонов в качестве акцептора водорода, отни. маемого от субстратов в дегидрогеназной 15 реакции 1 Ц.Наиболее близким по своей технической сущности к предлагаемому является способ, при,котором для определения дегидрогеназной активности в реакционную среду 20 вводят в качестве акцептора водорода и-бензохинон 121. В ходе реакции и-бензохинон восстанавливается до гидрохинона. Через разные, промежутки времени реакцию останавливают добавлением кислоты. Ко личество оставшегося хинона определяют титрованием и, таким образом, по убыли хинона судят о дегидрогеназной активности. Присутствие кислорода мешает определению хинона при наличии дифенолокси- зо дазной активности в исследуемом материале, поэтому определения выполняют в анаэробных условиях в пробирках Тунберга, Спектрофотометрический контроль активности по поглощению хинона в видимой области слектра хотя и возможен, но не дает преимуществ перед способом с титрованнем, так как и-бензохинон слабо поглощает в этой области.Наиболее существенными недостатками известного способа являются необходимость остановки реакции для.определения активности дегидрогеназ, применение трудоемкого тетриметрического способа определения количества хинона, использование а-бензохинона в относительно высоких концентрациях 10- 10 -М, что иногда вызывает ингибирование активности исследуемых дегидрогечаз, а также необходимость полного исключения кислорода из реакционной среды.Цель изобретения - расширение диапазона исследуемых объектов и осуществление возможности непрерывного контроля скорости дегидрогеназной реакции.Поставленная цель достигается тем, что в реакционную смесь дополнительно вводят менадионредуктазу, а в качестве акцептора водорода из ряда хинонов ислользуют анилинопроизводные о-банзохинола.Это позволяет проводить спектрофотометрический контроль дегидрогеназпсй реакции на максимуме поглощения хинона. Легко осуществим также полярографический контроль скорости дегидрогена зной реакции по поглощению кислорода, пошедшего на окисление аутоксидабельной дифенольной формы анилинопроизводнь х, ко торая возникает в системе при наличии де гидрогеназной активности. оВ силу высокой активности анилтп опроизводных о-бензохинона их применяют в концентрации в 10 - 100 раз ниже, чем а-бензохинон, что исключает побочные эффекты хинонов.5На фиг. 1 приведены кривые определения активности алкогольдегидрогеназы (а), глюкозо-фосфатдегидрогеназы (б) и изоцитратдегидрогеназы (в); на фиг. 2 график зависимости скорости, потребления кислорода в среде от количества препарата изоцигратдегидрогеназы при измерении ее активности по предлагаемому способу.Измерения активности изоцитратдегидрогеназы экстракта печени крысы по пред лагаемому способу в сравнении с другими способами приведены в таблице.Сущность изобретения поясняется схемой: 30Яегидрогеназа)Субстрат восстановленный + НАД ,Ф)На приведенной схеме о-хинон пред ставляет одно из анилинопроизводных о-бензохинона, а о-дифенол - восстановленную форму этого хинона, Реакция (1) проводится в очтимальных условиях для изучаемой дегидрогеназы. Скорость этой 45 реакции лимитирует скорость реакции (2). Как видно из схемы, реакция (2) выступаег как система, акцептирующая водород, появляющийся в основной дегидрогеназнои реакции (1),в результате окисления кон 50 кретного субстрата. Физико-химические свойства анилинопроизводных о-бензохинона позволяют контролировать активность дегидрогеназной реакции (1) по последовательной реакции (2), включающей анилинопроизводные о-бензохинона.Способ определения актизности НАД (ф) Н-генерирующих дегидрогеназ осуществляется следующим образом. Гото. вят среду, содержащую субстрат, НАД или 5 О НАДФ и другие компоненты, необходимые для проявления активности конкретной дегидрогеназы, в которую добавляют 4-ани. лино-метокси,2;бензохинон (АМОБХ) в количестве 1,00 - 150 мкмоль или какое-либо 65 другое анилинопроизводное о-бензохинона, а также препарат менадионредуктазы, взятой в относительном избытке с тем, тобы ее активность не лимитировала акгивность изучаемой дегидрогеназы. Полную реакционную среду переносят в закрытую кювету спектрофотометра, предназначенного для автоматической записи результатов из,мерений, или в полярографическую ячейку. В процессе измерений инкубационную смесь принудительно перемешивают. В среду вносят исследуемый образец,и фиксируют кинетическую кривую активносги дегидрогеназы (записывают изменение оптической плотности на максимуме поглощения анилинопроизводного о-бензохинона1 или регистрируют кинетическую криву;о поглощения,кислорода в полярографи-.еких опытах) .При измерениях по оптической плотности из среды удаляют кислород пропусканием азота или дожидаются естесгвенного истощения кислорода в кювете, что связано с быстрым окислением дифенольной формы производных.Активность дегидрогеназ выражают в общепринятых единицах с учетом сгехиометрии реакции.Пр и м е р 1. Определение активности алкогольдегидрогеназы (КФ 1.1.1.1,) .Готовят реакционную среду следующего состава: этанол 60 м иоль, НАД 350 лтмоль, АМОБХ 15 .якмоль, менадионредуктаза 0,5 мг, фосфатный буфер 0,08 М, рН 7,6. Среду переносят в полярографическую ячейку и автоматически регистрируют кинетическую кривую поглощения кислорода. Далее в полярографическую ячейку вводят 180 мкг очищенного препарата фермента, продолжая измерение скорости поглощения кислорода (см. фиг. 1 а).П р и м е р 2. Определение активности глюкозо-фосфат дегидрогеназы (КФ1.1.1.48) .В полярографическую ячейку вносят среду следующего состава: глюкозо-фосфат 550 мкмоль, НАДФ 360 мкмоль, АМОБХ 150 мкмоль, ЭДТА 3,3 ммоль, менадионредуктаза 0,5 мг, триэтаноламиновый буфер 33 ммоль, рН 7,6 и регистрируют поглощение кислорода, после введения 25 мкг фермента (см. фиг. 1 б).П р и м е р 3. Определение активности изоцигратдигидрогеназы (КФ 1.1.1.27) .В полярографичесяую ячейку внося 1 реакционную среду следующего состава: ДЛ- изоцитрат 6 ммоль, АМОБХ 150 мкмоль, НАДФ 300 мкмоль, менадионредуктаза 0,6 мг, трис-НС 1 буфер 0,08 М, рН 7,6, поглощение кислорода регистрируют после введения 320 мкг фермента и 1 ммоль МпЯО (см, фиг. 1 в).Внесение дегидрогеназы в полную пеакционную среду приводит к установлению стационарного режима в системе, при кото794071 дается линейная зависимость между количеством фермента,и скоростью изменения окончательного параметра, которым в данном случае является кислород.Таким образом, использование предлагаемого способа определения активности НАДН- н НАДФН-генерирующих дегидрогеназ позволяет в течение короткого периода времени получить точные данные об ак тивности дегидрогеназ в ходе самой реакции,Таблица Активностью изоцитратдсгидрогеназыв 1 лшн наг препарата, мкмольСпособ измерения 1575,2 11,2 5 20 176,6-, 4,9 6 175,2+ 6,7 30 ф Среднее :ьЯ -Как видно из таблицы, определение активности изоцитратдегидрогеназы по предлагаемому способу в сравнении с другими 35 независимыми способами дает совпадающие результаты.На фиг, 2 приведен график, из которого следует, что при измерении активности дегидрогеназ (на примере изоцитратдегидро геназы) по предлагаемому способу наблюром скорость поглощения кислорода постоянна и дегидрогеназная активность описывается кинетической кривой нулевого порядка. Цифры на линейных участках графиков соответствуют измеренным активностям дегидрогеназ. Спектрофотометрическоеизмерение восстановления 4-амилино-меток си,2-бе н зо хи н о н а предлагаемый способ) Измерение скорости изоцитратдегидрогеназной реакции по образованию НАЛфН (спектрофотометрический контроль при 340 нм) Измерение скорости окисления изоцитрата (контроль активности по изменению рН среды) Формула изобретения Способ определения активности НАДН- и НАД ФН-генерирующих дегидрогеназ, предусматривающий приготовление реакционной смеси, включающей хиноны в качестве акцептора водорода, инкубацию ее и определение остаточного количества акцептора, о г л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью расширения диапазона исследуемых объектов и осуществления непрерывного контроля скорости дегидрогеназной реакции, в реакционную смесь дополнительно вводят менадионредуктазу, и в ,качестве акцептора водорода из ряда хинонов используют анилинопроизводные о-бензохинона. Источники информации, принятые во внимание,при экспертизе:1. агапе %. Т 1 цпЬегд - Мейойй цпй Чегюапйе Ассер 1 ог - Мейодеп. - Напг зцсп сег РЬузо 1 орс 1- цпс Райо 1 орз 1 - СЬегпзсеп Апа 1 узе, 2 Вд, 1955, 339 - 340, 5 ргпдег - Чег 1 ад.2. Вегйо А. апс Сгоззтап %аЬогаогу Мейосз и ВосегпЫгуопдоп, 1938, р. 166 - 169 (прототип).