Способ получения вакцины против инфекций, вызываемых

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК ПАТЕНТУ Союз Советскии(51)М. Кл.з С 12 К 5/00 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытийДата опубликования описания 30,11,80(72) Авторы изобретения Иностранцы Юзуру Хомма и Казуюки Морихара(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗЫВАЕМЫХ РЗЕОООНОМА 5 АЕВООНОБА Изобретение относится к вакционно-сывороточному производству.Известен способ получения вакцины против инфекций, вызываемых Рвецдоаопав аегц 9(пова, на основе натурального эндотоксинного белка, полученного из Рвецдощопав аегцдпова (11 .Однако вакцина, полученная известным способом, обладает недостаточно высокой иммуногенностью.Целью изобретения является повышение иммуногенных свойств вакцины.Эта цель достигается тем, что натуральный эндотоксинный белок, токсоид эластаэы иэ Рвецдовопав аегцупоза и токсоид протеазы из Рвецдовопав аегц 9)поза растворяют в растворителе до концентрации 0,1- 20000 ( /мл, 1-4000 /мл и 1- 4000/мл соответственно исмешивают. их в,этих концентрациях в стерильных условиях.Кроме того, в качестве растворителя используют дистиллированную воду, физиологический раствор или фосфатно-буферный раствор хлористого натрия.С целью удлинения сроков хранениявакцину вводят антисептик тиморосал, фенол, карболовую кислоту илиформалин.,Способ осуществляют следующимобразом,5 Токсгид эластазы приготавливаютиз эластазы путем перевода ее в токсоид по обычной методике получениятоксоидов из белковых токсинов обработкой формальдегидом или оксиме 10 тансульфиновой кислотой.Чистый раствор эластазы (содержащий 10-15 мг ферментного белка на1 мл (50 единиц протеиназы на 1 мгферментного протеина), 5 молей хло 15 ристого натрия, 10 ммолей ацетатанатрия, 2 ммоля хлористого кальцияи 0,1 ммоль хлористого цинка), разбавляют буфером бората рН 9) доконцентрации фермента 2-5 мг/мл20 (окончательная концентрация боратасоставляет 0,1 И) и добавляют формалин до получения окончательнойконцентрации 1 Ъ (процентное соотношение объемов). Смесь выдерживают25 при комнатной температуре. Черезодин день достигается почти полнаядизактивация. Дезактивированный.таким образом раствор эластаэы диализируют водой и лиофнлиэируют30 до получения токсоида, 784796Под термином "единица протеиназы", используемым здесь, подразумевается активность протеиназы, определяемая по следующей методике.Казеин (2 по процентному соотноШению объемов, рН 7,4) (1 мл) смешивают с соответствующим образом разбавленным раствором фермента и по окончании реакции при 40 ОС в течение 10 мин немедленно добавляют останавливающий реакцию растВор, содержащий 0,1 моль трихлоруксусной кислоты, 0,2 моля уксусной кислоты и 0,2 моля ацетата натрия .(2 мл ), Смесь выдерживают при той же температуре 20 мин до полного осаждения непрореагировавшего каэеина и затем профильтровывают. ФильЪ- рат подвергают определению на тирозин по методике Фолайна. Увеличение 1 ед. тирозина в минуту указывает на активность протеиназы равную единице.Физические и химические свойства полученного таким образом токсоида эластазы следующие,Молекулярный вес: 47000 (фильтрация геля) .Спектр поглощения ультрафиолетового излучения; максимально 278 нм (Е 8 = 21,2,0,1 М КС Р), минимально2 О252 нм.Изозлектрическая точка; рН 6,5 (электрофореэ с ацетатной пленкой),Внешний вид; бесцветный порошок.Содержит остатки аминокислот, г/100 г белка: аспарагиновая 14,2, треонин 5,0; пролин 2,9, глицин 5,6; аланин 5,8, валин 4,9; метионин 2,9; изолейцин 2,7; лейцин 3,9; тирозин 9,9., фенилаланин 7,0; лизин 39; гистидин 2,6; аргинин 6,5; цистин 1,20 триптофан 2,3; аммиак 0,9, всего 94,7 г.Активность эластаэы не наблюдается.Активность антигена наблюдается.Токсоид протеазы может быть приготовлен из протеазы переводом ее в токсоид обработкой, например, формальдегидом или оксиметансульфинатом в присутствии аминокислоты.Пример получения токсоида протеазыКристаллы протеазы из Рьецдовопаь аеги 9 иова (100 мг) растворяют в 0,1 Мьрастворе йа 2 НР 04, содержащем 0,2 молялизина (около 20 мл) и добавляют формалин до получения окончательной концентрации 8 (процентное соотношение объемов ). Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 3-х или более дней и затем подвергают диализу водой и лиофилизации до получения токсоида.Физические и химические свойства полученного таким образом токсоида протеаэы следующие. Молекулярный вес: 63000 (фильтрация геля).Спектр поглощения ультрафиолетового излучения; максимально 280 нм(фокальный электрофорез),Внешний вид: бесцветный порошок,Содержит остатки аминокислот,г/100 г белка: аспарагиновая 15,6;10 треонин 5,0, серии 7,6, глутаминовая9,5, пролин 2,1; глицин 7,7; аланин8,5; валин 5,0; изолейцин 3,9; лейцин 8,7; тирозин 6,9, фенилаланин5,9, лизин 4,1; гистидин 1,9, арги 15 нин 2,3, триптофан 2,3; аммиак 1,4;всего 98,5 г.Активность протеазы не наблюдается.Активность антигена наблюдается.2 О Для получения вакцины инфекционно-защитный обычный антиген натурального эндотоксинного белка (НЭБ) ,токсоид эластазы и токсоид протеазырастворяют в растворителе в оптимальной пропорции. При необходимости вполученный раствор может быть добавлена усиливающая действие присадкаи/или антисептик.Растворитель может быть использован любой, приемлемый для приготовЗО ления вакцин для человека и животных, например, дистиллированнаявода, физиологический раствор хлористого натрия, раствор хлористогонатрия, содержащий фосфат в качестве35 буфера и т.д,В качестве присадки может бытьиспользована любая обычная присадка, например, гидроокись алюминия,фосфат алюминия, фосфат кальция,4 О квасцы или неполная присадка Фреунда.Количество присадки можно выбиратьиз предела количеств, необходимыхи достаточных для повышения активности иммунизации.РАнтисептик также может быть обычным, например, тимеросал, фенолили формалин.Для повышения защитного эффектапропорцию компонентов в вакцине можно изменять в пределах эффективных50 количеств. Количество каждого компонента значительно изменяется в зависимости от количества иммунизацийи от интервала между иммунизациями.Оно изменяется также в зависимостиот цели использования вакцины (т,е.профилактического или терапевтического).Ниже приводятся некоторые примеры предпочтительных доз и пропорций антигеновДля человека а также для рогатого скота) .,Когда иммунизацию проводят 2-3 раза в неделю (без присадки), предпочтительны следующие пропорции: НЭБ,0,1-10 ед. на 1 кг веса тела, токсоид протеазы 1-50 ед. на 1 кг весатела," токсоид эластазы 1-50 ед. на1 .кг веса тела. В зависимости от состояния иммунизации эти количествамогут быть увеличены.Профилактическая вакцина,Когда иммунизацию проводят двараза (с использованием присадки)предпочтительны следующие пропорции:НЭБ 10-2000 ед. на голову, токсоидпротеазы 10-2000 ед. на голову, токсоид эластазы 100-2000 ед, на голову,Когда иммунизацию проводят одинраз, рекомендуются следующие пропорции: НЭБ 500-2000 ед. на голову,токсоид протеазы 500-4000 ед. на голову, токсоид эластазы 500-4000 ед.на голову.Терапевтическая вакцина.Когда иммунизацию проводят 2 3 раза с интервалом н одну неделю (с использованием или без использованияусиливающей действие присадки), предпочтительны следующие пропорции:НЭБ 0,1-100 ед. на голову, токсоидпротеазы 10-2000 ед. на голову, токсоид эластазы 10-2000 ед. на голову.Вакцину можно вводить животнымили человеку внутримышечйо или подкожно.Токсичность каждого компонентав вакцине следующая.НЭБ: инъекция в брюшину мыши дозы 100 мг/кг вызывает временную астению, однако животное не погибает.При обычном испытании на кроликахв отношении свойств НЭБ вызыватьпирекцию наблюдается положительныйэффект с дозой 0,3 мг/кг. ТоксичностьНЭБ как эндотоксична очень мала всравнении с токсичностью липополиозы(ЛП ) и смеси НЭБ и ЛП.Токсоид эластазы и токсоид протеазы. Введение ннутрибрюшинно мышидозы 1 мг на вес мыши не вызываетострого отравления. Минимальная летальная доза протеазы составляет0,2 мг на вес мыши, а минимальная1 летальная доза эластазы - 0,125 мгна вес мыши.При иммунизации вакциной эффектзащиты от инфекций, вызываемыхР.аегцд 1 поьа, значительно увеличивается в сравнении с иммунизациейпростой вакциной, содержащей толькоНЭБ. Поэтому вакцина высоко эффективна.для профилактики и леченияинфекций, вызываемых Р,аегод 1 поьау животных и человека,Антитела или сыворотку, содержащую антитела, которую получают прививкой накцины животным и человеку,можно использовать для защиты ран(например язн, роговиц) от инфекций,вызываемых Рьецдощопав ае.гцд 1 пова,и для их лечения.П р и м е р 1. Раствор токсоидапротеазы и калиеных квасцов. 30 35 40 45 50 55 60 Б 5 Токсоид протеазы (100 мг) растворяют в водном растворе хлористого натрия, содержащем 24,8 мл фосфатного. буфера (рН 7,4), и добавляют 25 мл 10-ного раствора калиевых квасцовК 2 А 1 (50,)424 НО, К полученному раствору добавляют 2,5 мл 20-ного раствора НаНРО 12 Н 0 и устанавлиРвают рН 6,5, чтобы вызвать полное осаждение. После этого добавляют 1-ный раствор тимеросала (0,3 мл) н качестве антисептика (1 мг токсоида протеазы на 0,3 мл).Раствор токсоида эластазы и калиевых квасцов. Раствор приготовляют так же, как и н первом случае, но с использованием токсоида эластазы вместо токсоида протеазы.Раствор НЭБ и калиевых квасцов. НЭБ (100 мг) растворяют в 0,01 н. растворе НаОН (5 мл ) и добавляют фосатный буфер (28 мл) , К полученному раствору последовательно добавляют10-ный раствор калиевых квасцов(3,3 мл), после чего добавляют 1 ный раствор тимеросала (0,4 мл). Приготовленные таким образом растнор токсоида протеазы и алюминиевых квасцов, раствор токсоида эластазы и алюминиевых кнасцов и раствор НЭБ и алюминиевых кнасцов непосредственно перед использованием перемешивают. В 0,5 мл этого смешанного раствора содержится 500 ед. токсоида эластазы, 500 ед. токсоида протеазы и 500 ед. НЭБ.,П р и м е р 2. Раствор токсоида протеазы и гидроокиси алюминия, раствор токсоида эластазы и гидроокиси алюминия и раствор НЭБ и гидроокиси алюминия приготовляют так же, как в примере 1, но с использованием 10-ного раствора гидроокиси алюминия вместо 10-ного раствора калиевых квасцов.Приготовленные таким образом,три раствора перемешивают непосредственно перед использованием.Полученная вакцина обеспечивает гораздо больший эффект защит от инфекций, вызываемых Р.аегцд 1 поьа в сравнении с обычной вакциной, содержащей только НЭБ.При использовании одного НЭБ (группа А) 205 осоставляет 3,5 х 10 или меньше. В отличие от этого н группе Б, иммунизированной вакциной, 2 ОБО превышает 1,9 х 10 и, тем самым, она сущестненно отличается от группы А. В необработанной группе 20 бо составляет 3,4 х 10 о. При иммунизации 11 ЭБ величина ЕОбообычно от 100 до 1000 раз повышает сопротивление к (оличеству живых бактерий в сравнении с необработанной группой.При использовании йредлагаемой вакцины, содержащей токсоид протеазы(1) + (1) + (1)+(3 ) +1) + (1)+ (1)+( 2 )+2) + ( 3,6 х 10 1) + (1) )1,9 х 1 10 м е ч а н и я. Плюс означает гибель одного животног цифры в скобках - количество дней до .:бели, минус - выживание,ченную раих экспеа не Я -исло вы- .етом по риментов Ф Ф/ результа ажает величину, по результатам нескол проведенных ранее этого эксперимент( 0,1.4000/мл соотвют их в этих коных условиях.2, Способ пощ и й с я тем,рителя используводу, Физиологифосфатно-буферннатрия. етственно и смеши предлагаемымышенными имму Вакцина, полученна пособом, обладает по огенными свойствами. ериль. нцентрация а ю раство- нную или истого п 1, о тли то в качеств т дистиллиро еский раство й раствор хл Формула изобретения с сро ант лов епт кис И. Спиридонова Техред М. Кузьма Корректор Г, Назарова акт Подписноета СССРтий Заказ 85 68 Тираж 522 НИИПИ Государственного коми по делам изобретений и отк 5, Москва, Х(-35, Раушская н 11303 Филиал ППП "Патент", г. Укгоро Проектн 1, Способ получения вакцины тив инфекций, вызываемых Рьецд аегц 91 поьа на основе натуральн эндотоксинного белка, полученн из Рьецдовопаь аегц 9 поьа, о т ч а ю щ и й с я тем, что, с ц повышения йммуногенных свойств цины, натуральный эндотоксинны лок, токсоид эластазы из Рьецд аегц 9 поьа и токсоид протеазы Рьецдооопаь аегц 9 поьа раствор в растворителе до концентрации 2000 /мл, 1-4000 /мл и 1 проаопа ь го го л и .лью вак- бепопаь з ют 0,1 соб по п.1, о т л и ч а ютем, что, с целью удлинен анения, в вакцину вводят к тимеросал, Фенол,. карболоту или Формалин. сточники информации во внимание при экспе мма Д,Ю. Иммунитет, со ратами микроорганизмоТокийского университ 267-279.