Способ выделения -триптофана

О П Союз Советских Социалистических Республик7498 ЗОБРЕТЕНАВТОРСКОМУ СВИ ЕТЕЛЬС ь) Заяв ением заявки й присоедин 23) Приорит 12 0 13/06 осударственный комите СССР ио делам изобретений и открытий.Ф. Молин и Е.Р, Роша есоюзный научно-исследовательский институт генетик и селекции промышленных микроорганизмов 1 Заявител ПОСОВ ЛЕНИ РИПТОФАНА пс 5 оИзобретение относится к микробиологической промышленности, а именнок способу выделения -триптофанаиэ растворов.Известен способ выделения (.-три. тофана с помощью активированногоугля )1 . Однако этот способ малоэффективен и имеет существенные недостатки,связанные, например, с трудностью десорбции -триптофана с активированного угля.Известен также ионообменныйметодвыделенйя (.-триптофана с использованием синтетических ионитов 2). К недостаткам указанного метода можно отнести то, что в нем предусмотренаочистка триптофана лишь от другихаминокислот, а сорбционная емкость.сорбентов по отношению к триптофануиспользуется неэффективно.Наиболее близким техническим реффкф ЮеййИ 3 Тй=своей сущности и достигаемому, эффекту является способ выделе-"=/ Т ния (,-триптоФана из растворов путем Мю ът ю 1 =-==-== десорбции полученного элюата и кри- кфифсиллиЪации Я .ВВ йТЪМата.ьюуор ируют на полистирольном сульфокатионите или высокоосновном анионите. Примесные аминокислоты удаляют,со смолы пропусканием раствора минеральной соли. Десорбируют триптофанраствором щелочи или аммиака (в случае катионитов) или минеральнымикислотами (в случае анионитов),1.-триптофан выделяют из элюатов путем многократного упаривания последних споследующей кристаллизацией и перекристаллиэацией.Недостатком этого способа являетя то, что он позволяет в основномтделить -триптофан от других аминокислот, что ограничивает его возможности при выделении -триптофана израстворов, содержащих значительныеколичества иных примесей, например, ;у минеральных солей, окрашенных соединений. Как и в способе )21 сорбционная емкость ионитов используется неэффективно, контакт сорбентов с растворами, содержащими в больших коЯ 5 личествах окрашенные и другйе примеси, приводит к необратимой потере .обменной емкости сорбентов и ухудшению их работы от цикла к циклу,10 того продукта применяют такие трудоемкиеи энергоемкие операции какмногократное упаривание, криСталли- зацию и перекристаллизацию. Выходтриптофана 1 около 50 недостаточно велйк. Указанные недостатки затрудняют использование этого способа в промышленности.Целью изобретения является разработка более эффективного и технологичного способа выделения Е-триптофана из растворов, содержащих большое количество минеральных и органических примесей, который позволил быполучать -триптофан в промьдаленныхусловиях с высокой чистотой и с высоким выходом.Поставленная цель достигается тем,что сорбцию -триптофана осуществляютна макропористом слабоосновном анионите, а после десорбции с анионитаиз полученного элюата -триптофанповторно сорбируют на сульфокатионите в Н-форме с последующей десорбцией -триптофанас катионита.При этом для десорбции -триптофана с анионита используют обессоленную воду И/или растворы минеральныхкислот в концентрации 0,1-0,5 М притемпературе 10;25 ОС. Для десорбциитриптофана с катионита применяют1,5-3,0 раствор аммиака в водномрастворе этанола при температуре 4070 оС.Согласно предлагаемому способукристаллизацию триптофана из аммиачНо-спиртдвых элюатов целесообразноосуществлять путем подкисления последних уксусной кислотой до рН 3,54,0 с последующим охлаждением до 05 СПредлагаемый способ осуществляютследующим образом.Содержащую -триптофан культураль ную жидкость пропускают через колонку с макропористым сорбентом (например, ИАр). При этом -триптофансорбируется,тогда как минеральныесоли, другие аминокислоты и неионогенные компоненты питательной средынеароматического характера практически не поглощаются смолой. Во избежание заиливания сорбента И седиментации микробных клеток в колоннерастворв"колонку подают в направлений снизу вверх. С другой стороны,такой способ подачи раствора существенно улучшает динамику сорбцииЕ-триптофана и исключает слеживаниесмолы. Диапазон оптимальных значений рН подаваемого раствора от 1,0до 7,0.По окончании сорбции колонка ссорбентом промывается.водой,В случае наличия окрашенных приме. сей в исходном растворе элюцию (.-триптофана следует .проводить водой прикомнатной температуре с одновременнойподачей триптофансодержащего элюата фна колонку с. сульфокатионитом(КУ-8, дауэкс 50 Ч) в Н-Форме, Придесорбции с анионита раствор пропускают через колонку сверху вниз, апри сорбции на сульфокатионитЕ снизувверх. Благодаря отсутствию минеральных солей и целЬго ряда другихпримесей сульфокатиониты поглощаюттриптофан с высокой эффективностью.Одновременно с концентрированиемпроисходит дальнейшая очистка триптофана от окрашенных примесей. Дляповыщения чистоты конечного продукта осуществляют промывку катионита вколонне горячей водой при температу-ре 50-90 С,Элюцию триптофана с катионита проводят 1,5-3,0 раствором аммиака вводном растворе этанола при 50-70 оС.Этот способ элюирования позволяет из 20 бежать кристаллизации десорбированного триптофана в колонке и осущест.вить ее в приемнике фракций злюата,не прибегая к многократному упариванию элюата. Во фракциях с содержа 25 нием триптофана более 10 г/л приохлаждении и нейтрализации в уксуснойкислоте происходит кристаллизация-триптофана. Выдавшие кристаллы,содержащие -триптофан, уксусную кислоту и воду, отфильтровывают, промывают этанолом и высушивают в вакуумеопри температуре порядка 50 С.Уже на этом этапе способ позволяет получать продукт с содержаниемосновного вещества порядка 99 и выходом около 50.Кристаллический продукт можетбыть подвергнут дополнительной очистке известным методом, включающим обработку активированным углем и пере 40 кристаллизацию из водноэтанольныхрастворов.Фракции аммиачного злюата могутбыть обработаны известными методами,включающими упаривание, кристаллиэа 45 цию и перекрйсталлизацию или возвращены на стадию сорбции на анионитепоследующего техйологического цикла.Таким образом, общий выход кристаллического .-триптофана может быть50 увеличен до б 0-70,По предлагаемому способу (.-триптофан получают со следующими характеристиками; выход кристаллического-триптофана 50-70, содержание основного вещества не менее 99, удельное оптическое вращение +30-31 (с:1,оНО),влажность не более 1,0, золь".ность (сульфатная) не более 0,1,содержание примесей: сульфаты не более 0,01, хлориды не более 0,01,60 железо не более 0,001, тяжелые ме- фталлы не более 0,001, Продукт не содержит примесей других аминокислот,йетоксичен и непирогенен.Способ поясняется следующими при-,.65 мерами.П р и м е р 1. 2 л раствора со-. Мяонну со смолой КУ-8 промываютрй держащего 16 г -триптофана 8,4 г " .О,5 л воды при температуре 70 С со (.-аланина, 5,6 г глицина, 7,0 г ва- . скоростью 0,2 л/час. лина, 10 г лизинхлоргидрата и 4 г Элюирование триптофана со смолы -глутаминовой кислоты, подают на КУ-8 проводят 0,5 л 1,5 раствора :колонну с ИАр (объем смолы 0,45 л) 5 аммиака в 50 водном растворе этанов направлении снизу вверх со ско- ла при температуре 58 С. Элюат собиростью 0,5 л/час. После обнаружения рают по Фракцйям. Первая Фракция .-триптофана в. Фильтрате (пропуще- объемоМ 100 мл содержит триптофан в но 1,85 л) фильтрат подают на вторую концентрации 0,15 г/л. Эту Фракцию . колонну с ИАр (объем смолы 0,1 л), 10 направляют на стадию сорбции на смоКолонны промывают 0,85 л воды ле ИАр в последующем цикле. Вто(до обнаружения -триптофана на вы- рая фракция объемом 70 мл содержит ходе из второй колонны), после чего триптофан в концентрации 48 г/л, Эту проводят десорбцию 0,2 н НС с обеихфракцию обрабатывают 5,0 мл ледяной . колонн, пропуская раствор в направле- Уксусной кислоты до РН 4,10 и охлажнии сверху вниз со скоростьюдают до 5 С. Выпавшие кристаллы отО0,35 л/час. Одновременно элюат подают деляют Фильтрованием, промываютэтана колонну с Кув Н-форме (объем . иолом и высушивают в вакууме. В ресмолы 110 мл) в направлении снизу . зультате получается 3,02 г кристалливверх. Элюцию кислотой прекращают . ческого триптофана, хроматографически после прохождения 7 л раствора. Элю чистого с содержанием основного вецию-триптофана с КУпроводят щества 99, Выход -триптофана в кри 2,0 раствором аммиака в 50 раство- сталлическом продукте составляет ре этанола при температуре 63 С, по. Содержание триптофана в мадавая раствор сверху вниз со ско- точном растворе составляет 5,2 г/л, ростью 80 мл/час. Первую фракцию 25 объем маточного раствора 65 мл, а объемом 90 мл отбрасывают. Вторую вместе с промывными водами 80 мл, фракцию объемом 250 мл, содержащую Этот раствор после отгонки спирта(.-триптофан в концентрации более подают на стадию сорбции на смоле 7,0 г/л, обрабатывают 20 мл ледяной ИАР в последующем цикле. Третья уксусной кислоты до рн 4,5 и Охлаж фракция элюата объемом 350 мл содердают в течение 20 час притемперату- жит триптофан в концентрации 4,2 г/л, ре 3-5 С., Выпавшие кристаллы отфильт- ту фракцию Упаривают в вакууме до ровывают, промывают охлажденным эта- бъема 18 мл и охлаждают при 5 С,об а 18онолом и высушивают при 40 оС. . Выпавшие кристаллы триптофана отдеВ результате получают 11,9 г крис-)5 ляют Фильтрованием, промывают этаноталлического -трилтофана с содержа- .лом и высушивают. В результате полунием основного вещества более 99. чают 1,15 г триптофана с содержанием основного вещества 95. ОбщийП р и м е р 2. Исходным матерна выход триптофана в кристаллическомлом для выделения -триптофана явля продукте составляет 66. Маточныйется ферментационная среда, получен 4 раствор после кристаллизации триптоная в результате культивированияФана из третьей Фракции элюата возштамма Вас. цЬс Р ВНИИгенети- вращают на стадию сорбции на смолека 3557 на питательной среде содер .ИАв последующих циклах. жащей сахар, кукурузный экстракт, мо-.чевину, соли фосфорнокислого калия, 45 П р и м е р 3. Культуральная жидсернокислый магний, хлористый натрйй. кость та же, что в примере 1. Объем Концентрация -триптофана 6,20 г/л, культуральной жидкости 2,6 литра.1 литр культуральной жидкости подают . Объем анионита ИАр составляет 0,5 л, на колонну со смолой ИАр объемом Условия сорбции и десорбции трипто,25 л снизу вверх со скоростью 50 фана в случаесмолы ИАр аналогичныусловиям примера 1 за исключением то,5 л воды в том же направлении с го, что промывку колонны после сорбтой же скоростью. После пропускания ции производят 1,0 литром воды, а первых 0,2 л воды и обнаружения вэлюцию трийтофана с анионита 6,0 литыходящем растворе триптофана в сле Рами воды , Рми во ы. Элюат содержащий триптодовых концентрациях выходящиц р иях выходящий раст- . Фан, минуя промежуточную емкость, пос сулькатионитом вор направляют на вторую колонну со дают на колонну с су смолой ИАр (объем смолы 250 мл), Дауэкс 50 Чх 4 20/50 щеьЬ в Н-форме,взятым в объеме 70 мл снизу вверх соДесорбцию -триптофана с первойклонны осуществляют 3,0 л воды, по- скоростью , /ско остью 0 2 л/час. По окончании даваемой со скоростьюю 0 2 л/час в 60 сорбции триптофана колонну с сульфонаправлении сверху вниз Элюат, со- катионитом промывают 0,5 л воды при держащий триптофан, пропускают с той темпер уртемпе ат е 750 С в направлении сниз вве х со скоростью 0,2 л/час.Элюи ование триптофана со смолы же скоростью через колонну с 80 мл зу вверх рЧх п ово ят 0,5 л 1,7 сульфокатионита Ку-8 в Н-форме в . Элюирова е р Ф направлении снизу вверх. затем ко-65,Дауэкс 50 х 4 пр д749889 формула изобретения раствора аммиака в 50 водном растворе этанола при. температуре 63 оС, Первую фракцию объемом.70 мл, содержащую триптофан в концентрации 0,20 г/л, направляют .на стадию сорбции на анионите .ИАр в последующем цикле. Вторую фракцию элюата с сульфокатионита объемом 90 мл,содержащую триптофан в концентрации 80,5 г/л, обрабатывают 5,5 мл ледяной уксусной кислоты до рН 4,15 и охлаждают до 50 С. "Выпав-О ;:ие кристаллы обрабатываЮт так же, как в примере 1В результате полу чают б,55 г кристаллического -триптофана, хроматографическй чистого, с содержанием основного вещества 99. Выход -триптофана в кристаллическом продукте составляет 51,2. Маточный растВор объемом 78 млс "содержанием триптофана 5,1 г/л и промывные воды после отгонки спирта возвращают на стадию сорбции на анионите ИАв по О следующем цикле. Третью Фракцию элюата объемом 315 мл .с содержанием триптофана в концентрации 6,5 .г/л упаривают до объема 30 мл и охлаждают при 5 фС. Вьшавшие кристаллы отделяют 25 Фильтрованием, промывают этанолом и высушивают., В результате получается 1;98 г кристаллического триптофана с .содержанием основного вещества 96.Общий выход триптофана в кристал- ЗО лическом продукте составляет 67,2.Кристаллы триптофана с-содержа- нием основного вещества 96 перекристаллизовывают. Для этого 2,25 г три птофана растворяют в 25 мл 50- эта нола при нагревании. В раствор добавляюта" 0,4 г актйвированйого угля, горячий раствор фильтруют, Фильтрат охлаждают й выпавшие кристаллы трип"тофанаотфильтровывают, промывают 4 О этанолом и высушивают, В результате получают 1,56 г триптофана, хромато- графически чистого, с содержанием основного вещества 99. Выход на стадии перекристаллизации составляет 72 45 в пересчете на триптофан с содержанием основного вещества 100;1. Способ выделения -триптофанаиз растворов путем сорбции его наионообменных смолах, десорбции полученного элюата и кристаллизации,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью повышения эффективности протцесса, а также получения готовогопродукта, свободного от примесей,сорбцию Е-триптофана осуществляют намакропористом слабоосновном анионите, а после десорбции с анионита изполученного элюата Е-триптофан повторно сорбируют на сульфокатионитев Н-Форме с последующей десорбцией-триптофана с катионита.2. Способ по н. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что десорбцию -триптофана с анионита осуществляют обессоленной водой и/или растворами минеральных кислот в концентрации 0,10,5 М при температуре 10-253. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что десорбцию Е-триптофана с катионита осуществляют 1,53,0 раствором аммиака в водном растворе этанола при температуре 40-70 С.4. Способ по п. 1, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что кристаллизацию-триптофана из аммиачно-спиртовыхэлюатов проводят путем подкисленияпоследних уксусной кислотой до рН3,5-4,0 с последующим охлаждениемдо 0-5 С.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Патент США Р 2.416.956, опублик. 1947,2. Патент США Р 2.700.672, опублик. 1955.3. Патент США У 3.450,712, опублик. 1969 (прототип), Составитель В. МаксимоваРедактор Н. Козлова . Техред Ж. Кастелевкч Корректор С. Шекмар4 Ъ ю ю ю 4 йИт ю аав " в тт" "Ът, а " Нейаеетююав твеетееюатаевв юйетт ттЗаказ 455 б/19 Тираж 522 ПодписноеЦНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/54 ааеюва вава тата втт тее тювйттютететюте аваФилиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4