Способ получения антивирусных препаратов из дрожжей

Союз Советских Социалистичеших Республик) М. Кл."С 12 К 50( А 01 Х 1500 2) Заявлено 01.03.8 (21) 2584504/30-15 присоединением заявки-23) Приоритет - Опубликовано 25.09.79. Дата опубликования оп Государственный ноинт СССР оо делам иэооротенои н открытий(53) УДК 5(7.15, .072:632.981 (088.8) ллетень35 ания 05.10.7 72) Авторы изобретения Бобы Коваленко и 1) Заявит ститут микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотно) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТО ИЗ ДРОЖЖЕЙвляет полч способу можно выепараты как из клекультуральной жидлимо последовательгцих операций.горса 1 з К - 41 выах на аэрированной о предлагаемомуть антивирусные прдрожжей, так и изГ 1 ри этом необховыполнение слелтчорожжи Сапддавают в ферментер делиток20 костное ы Кдуцента я от ра- высою усваприменением рас в качестве про тв, отличающейс дрожжей боле ю и способность Это достигается Сапд 1 да (гор 1 са 1 з антивирусных вещес нее использованных кой продуктивность ащ Изобретение относится к технологии получении физиологически активных веществ для сельского хозяйства.Известен способ получения антивирусных веществ, преимущественно из дрожжей Сапд 1 да 1 гор 1 са 11 з Зв и Сапд 1 да агЬогеа КАМ, выращиваемых на солодовом сусле 1. Этот способ включает операции отделения дрожжевь 1 х клеток от культуральной жидкости, концентрирования культуральной жидкости в вакууме, центрифугирования, диализа и осаждения целевого продукта органическим растворителем, обработки рибонуклеазой, фенолом и органическим растворителем.Недостатком известного способа я ся низкий выход, малая активность чаемого продукта.Целью изобретения является повышение активности и выхода антивирусных препаратов. ивать углерод из пищевого сырья прн повышенных температурных режимах культивирования. Применение минеральной среды Ридер с глюкозой и биотином для выращивания дрожжей способствует накоплению значительных количеств антивирусных веществ. Кроме того, концентрирование и очистка веществ с антивирусной активностью достигаются диализом через полупроницаемую мембрану против высокомолекулярного гидрофильного вещества - полиэтиленгликоля. Из технологической схемы приготовления антивирусных препаратов исключается дорогостоящая рибонуклеазная обработка, а окончательное высушивание препарата производится путем сублимации, что обеспечивает его хорошую растворимость в воле и высок ю активность.жидкой среде Ридер следующего состава (г/л): (1 Нд)р 804 3, хаС 0,3; Мд 80 0,4; КН 2 РО 1; К 2 НРО 4 0,1; глюкоза 25; биотин 2 мкг/л.Дрожжевые клетки от культуральной жидкости отделяют центрифуги рованием (3000 об/мин в течение 15 мин), высушивают в сублимационндй сушке при 30 С, давлении 10 н/м и используют отдельно для получения различных препаратов.Биомассу дрожжей гомогенизируют в сухом и влажном виде в присутствии абразива, растворимые вещества экстра гируют теплой (до 45 С) водой и концентрируют с помощью водного раствора высокомолекулярногоо полиэтиленгликоля ( молекулярна я м асса ) 15000) через пол уп ро ница ем ую ( целлофановую) мембрану. Растворенные в воде 1 концентраты культуральной жидкости или дрожжевого экстракта центрифугируют (5000 об/мин в течение 15 мин) для удаления нерастворимого остатка, добавляют равный объем смеси водонасыщенного фе нола к н-бутанола (0:1) и эмульгируют при комнатной температуре в течение 30 мин. Водную фазу отделяют центрифугированием (3000 об/мин в течение 30 мин), диализируют против проточной воды (48 час) для удаления остатков феноал и и-бутанола и концентрируют до минимального обьема (0,2 - 0,3 л с помощью полиэтиленгликоля через полупроницаемую мембрану. Целевой продукт из концентрата осаждают органическим растворителем (80 О/О-ным 30 этанолом) при низкой (2 С) температуре. Осадок уплотняют центрифутированием (5000 об/мин в течение 15 мин) и расгворяют в теплой (до 45 С) воде. Раствор центрифугируют (5000 об/мин в течение 15 мин) осадок отбрасывают, а супернатант повторно обрабатывают фенолом и органическими растворителями, как указано выше. Окончательное высушивание препарата из водного раствора осуществляют в сублимационной суирке (-30 С, ОЗ н/м)Пример 1. В качестве источника антивирусного препарата использована биомасса дрожжей Сапс(1 да 1 горса 11 з К - 41. Из 500 г сухих дрожжей по предлагаемому способу получено 11,0 г препарата, что составляет 2,2 вес./О исходного материала. Пре парат имеет вид аморфного белого порошка, хорошо растворим в воде, в растворе термостабилен. Влажность лиофилизированного препарата 5,00/О, препарат слабо гигроскопичен, может длительное время храниться в сухом месте без изменения физических свойств и антивирусной активности.Пример 2. В качестве источника антивирусного препарата использована культура льная жидкость, не содержащая дрожжевых клеток. Из 20 л культуральной жидкости (около 50 г сухих веществ) по предлагаемому способу получено 2,2 г препарата, т. е, около 4,4 вес,/О исходного продукта. Выделенный препарат - белый аморфный порошок, хорошо растворим в воде, в растворе термостабилен, его влажность не превышает 60/О; может храниться длительное время в сухом месте без потери порошковидной консистенции, растворимости и антивирусной активности.Общий выход препаратов из биомассы и культуральной жидкости дрожжей достигает 3,3/О сухого веса исходного материала.В табл.приведены сведения о химическом составе препаратов, в табл. 2 и 3 - результаты испытания их активности в отношении вируса табачной мозаики и Х-вируса картофеля.Прспараты состоят преимущественно из полисахаридов (около 70"/,), примеси белков не превышают- 3"/ нуклеиновых кислот 0.2 - 0,26/О (табл. 1). Седиметационным анализом установлена гомогенность препарата, выделенного из дрожжевых клеток, молекулярная масса присутствующего в нем полисахарида маннана равна 14000. Препарат, полученный из культуральной жидкости дрожжей - полидисперсный.Оба препарата обладают выраженной активностью в отношении вируса табачной мозаики и Х-вируса картофеля: 50/,-ное снижение инфекционности вируса табачной мозаики наблюдается в 0,000 - 0,001/О-ной концентрации препаратов (табл. 2). Препараты подавляют накопление Х-вируса картофеля в листьях дурмана, реагирующих системным заболеванием на заражение этим вирусом (табл. 3), и увеличивают выход безвирусных растений в культуре апикальных меристем.687120 Табпнпа 1 Хнмнческнй составаытнвнрусных.препаратов, полученных нз дрожжей аюдага Ьорыйй К(% сухого веса препарата) Источннк Редупкрующне вещества,обнаруженные в гидро- лнзатах Бепкн Нукпенновыекнспоты Н укпеотндный(РНК) Обшнй мнкромето- антроповымдом Хаге- методомдорна-Иен- сена Кпеткн 70,7 0,03 1,0 66,7 0,26 следы Культурапьнаяжидкость 68,7 3,0 68,6 0,02 021 следы П р н м е ч а н н е: Редупнруюшне вещества, обнаруженные в гндропнзатах, в 2 п. растворе Н ЯОпрн 100 С в течение 6 час,Таблица 2Инантнвапня внруса табачной мозаики препаратами, полученнымн нз дрожжейЙлсйда Ьирсаб.5 КСреднее количество нек розов на 1 У 2 пнстаРа 1 ца 5 Ь агиопьип х) Конпентрапня препарата, % Источник препарата Инактнвапня вируса% в опытев контроле 97,8 9,0 0,2 0,1 Клетки 27,5 0,010 001 0,7 27,3 2,8 51,3 8,2 0,0001 4,0 0,3 0,1 0,01 2,3 9,5 5,3 П р н м е ч а н н е: Опытные половинки листьев 3 Ыига ЬЬащопшт ннокулнровалнвирусом табачной мозаики в присутствии антнвнрусного препаратав соответствующей концентрации, контропьные - вирусом без антнвнрусного препарата. Культурапьнаяжидкость 0,0010,0001 20,030,2 19,2 7,0 97,5 89,7 98,5 92,4 50,4 24,3687120 Табпица 3 Впияние антивирусных препаратов па репродукцию Х- вггруса картофеля в пистьяхУайли.а. 5 Ььпопсит Источник препарата Концентрация препарата, % Ивфекпвонность вируса в экстрактахиз пвстьев БйЬл"а йгапсоп,ситкупьтивируемых Снижение ивфекционности,%на растворе интибитора на воде КпеткиСапсН,с/аЬ орьСабьв 0,1 307 456 35,1 Р( 0,1 КупьтурапьваяжидюстьСаЫЫаЬ о 1 ясайЗ 0,1 42 187 87,5 Р ( 0,5 1, Опытные половинки пистьев содержат в течение 2 дней ва раствореингибитора контрольные - ва воде, а затем ивокупируют Х-вирусомкартофеля, титр вируса опредепяют ва 7-й день опыта путем подсчетаместных некрозов, образовавшихся в резупьтате инокупяции экстрактамилистьев гомфревы.2, Р- уровень значимости разности инфекционности вируса в опыте и ковтропе, %. Примечания: формула изобретения Составитель М. БелоусоваТехред О. Луговая Корректор М. Вигула Тираж 526 Подписное Редактор Д. Пинчук Заказ 5675/27 ЦН И И П И Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж - 35, Раушская иаб., д. 4/5 филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4Способ получения антивирусных препаратов из дрожжей, включающий культивирование дрожжей, отделение от культуральной жидкости дрожжевых клеток и раздельную обработку их путем концентрирования культуральной жидкости в вакууме, а дрожжевых клеток путем гомогенизации, экстракции, концентрирования экстракта, диализа, осаждения целевого продукта, обработки его фенолом и органическими растворителями, отличающийся тем, что, с целью повышения активности и выхода антивирусного препарата, в качестве исходной культуры дрожжеи используют расу К - 41 Сапйс 1 а 1 гор 1 са 115, культивирование которой проводят на минеральной среде Ридер с глюкозой и биотином, а концентрирование дрожжевого экстракта проводят полиэтиленгликолем через полупроницаемую мембрану и после обработки фенолом и органическим растворителем целевой продукт из дрожжевого экстракта высушивают сублимацией. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Авторское свидетельство СССР302368, кл. С 12 К 5/00, 1971.