Способ получения антибиотика -11743а

Свез Советснна Социалистических респубяни(511 В. Кл С 12 Э 9/14 Государстаеиный комитет СССР по делам изобретеиий и открытий(72) Автори изобретения Иностранная фирма Сандос АГ(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА -11743/А Изобретение относится к микробно- Целью изобретения является способтогической промышленности и касается 6 олучения антибиотика 5 11743/Аполучения антибиотиков. формулыПредложенный антибиотик является)новым и способ егойолуЧения не ойисан.в гЯф Н 11,Сигается тем, чтопгыЬлЬгОз нияз 8088тательной среде, соки азота, углеродали, с последующимого продукта в видеКроме того, вырасуществляют на писодержащей дополементы,аммапродуцнрующегооннрована в Опйед ЫаАдНсцйцее (ног Юег п Эта цель дост штанги ЗЬерВоптзсе выращивают на пи держащей источни и минеральные со выделением целев кислоты или соли щивание штамма о тательной среде нительно микрозл Культура шт-11743/А, деп 1 еь 1:герог 1 апмой оО 11 Ха 11 оь ЙЕМагьсйтт ОПб ВВгтЕ тно(ъгт)ЕМ 21 е 11 , ог),Реог 1 а В,США поц номеромйй 1 Ь 8088Штамм Ыгерт",ог;1 зсе вцКОЫЬа выделен из пробЫ земли, собранной в 1965 г в Центральной Африке.Культурально-морфологические при 4 знаки.Воздушный мицелий от свинцовосеребристо-.серого и цепи спор разветвлены моноподиально, иногда симподиально. Цепи состоят из неодииаовых, открытых спиралей, иногда с2-3 витками.643085 4Споры гладкие, овальной Формы от ,дельноСп от ,дельно и экстра ты обрабатывают далско , шири- по отдельнееО 7-0 9 1 33-1 5На среде с солодовым экстракт0 мкм, Антибиотик 5 -11 743/А выделяютрост отличный, золотисто-коррактом предпочти тельичневого солей елно в Форме соли причемФцвета, воздушный мицелийсерого цвета, Фор 1 а мицелия - открысвинцово- мельныхщ очных металлов, щелочноэеых металлов или аммония.целия - о кры- о Антибиотик - 743/А в Фрм гопигментов нет.мых аморфной и содержащей ацетон, крисКрахмал-агар-рост очень х йталлической нороши лической кко натриевой соли и кристалбежевого цвета воздушный мицелий дю малиевой соли обладает слесерый, открытые спиралиу щи и свойствами,пирали и загибы, Элементрастворимых пигментов нет, Юарный состав аморфной нат иеОв янс ая мука с агаром - рост хоровой соли.риеший от желто-кори нйЬ до бежевго цвета, воздушный мицелий бто-серого цвета, растворимых пигмеи бфтов нет. 15 0 24,1.мых пигмеи- Найдено,Фг С 635 Н 9 1 ИЗ 2ю ю ) Зю 2)Среда Чапека - рост среднийкремового до коричневого ъни , от Т,пл.оэдушныйкристаллиэоаморфной Иа-соли 166-169 Сванной с ацетОном Ца-солиримые пигменты коричневого цвета. Ж 3ораство- . т.пл 159-16ГметанолеМ(СО)оричневого Ма-солир Рцвета, воздушный мицелий светхорошо растворимы в ОрганиРый, растворимый пигмент желтый.тло-се- ческих растворителях, таких как тоЛуол; бенэол, хлористый метнлен,Рлюкозо-глицериновый агар -этилацетат и- рост дб метанол. Вэопропилацетат, этанолУхороший, золотисто-коричневый воз-творимы,воде соли плохо расдушный мицелий серый, открытые спи- Калиевая соль нтРали, 2-3 витка, растворимый пигменткоричневый.11743/Апигмент 17 3/А имеет элементарный составХорошо растет и усваивает глюкозу, 30 Вйчислено В: С 62арабинозу, И зу .маннит Фру т эурамнозу, крахмалы, галактоэу глицрин, целлобиозу, декстрин манноэур ие- Найдено В: С б0 - не оп е еляк й 61 у 9 Н 8 г 93 К 48 уРост средний на иноэите, ПлохоР деляли.растет и свте, лохо Т.пл. 58-160 С.и усваивает сахарозу, сорбит, , Удельное вращенйеяблочную кислоту, не усваивает рафи Цв метаноле + 69 1"(С=О 98))фДУЛЬЦИТзу, салицин, инулин, (ффв хлороформе +102 0 (С=1 10)Р ф ефизиологические свойства.Антибиотик-11743/А можно испольВосстайавлнвает нитраты гидРОли- ва он Обладает, анти изовать в качестве лечебзует крахмал целлюлОэу не Разлагаеттирозиновая реакция отрицателзлагает, тивностью против тьная, мов, как г амР таких микроорганизмолоко не коагулирует бсла о пелто- н грибы.Рамположительные бактериивизирует молоко, плохо разжижает же- Алатину, меланин не образуетнтибиотик- ьОлОгически созмести11743/А и его физиВыращивание штамма ЮгерЮ 8088 жущжао б.овсез то- йспользованы и иныМ и иммерсионным способоМт аэронедостаточноста также для леРДля получения антибиот ика леваний.дл лечения коронарных забо.-11743/А предпочтительно применяютвегетативную форму штамма для ино ук Аляции продуцирующей среды.нтибиотик б 11743/А в форме кислоты или ее солей можеттдля этого сначала получают вегета- в медивный инокулят микроорганизма путем срдицине в качестве лекарственногоинокуляции небольшого количества ветствующейлека ствкультуральной средй суспензией спор в карственной форме дляштамма Ыгер 1 ощчсез то 1 Ои 61 в ййЧЬвнутривенного энтрентерального введении,энтерального или па 8088. Часть мицелия в культуральном 55бульоне переводят и растворимУю фор- Пму Разлагают и соединение ПолуЧают дУ Р 1 . Культуральйую ЬреРимеизвестным Образом с помощью экстрак- Ще состйва г/Лциоиных или абсорбционных методов, Церелоэа (глюкоза) 4,0но также можно сначала отцентрифу 60 СолодОВый эхсТракт 10 ОРоватьмицелий от культураль 60 .ДРожжевой экстракт 4 0ного Вакто-агарю (среда й )бульона, фильтрат культуры и мицелий20 0,после расйределения экстрагируют РазДистиллированС ЮВЙвода 1 линфицируют приготовленной суспензией спор первоначально выделенного штамма Ыгер 1 отпчсеэ воСаЬЮ нйЯЬ 8088, В среде перед стерилиз ацией с помощью МаОН устанавливают рН 8,3-8,6, После стерилизации (20 мин при температуре 120 С) устанавливают РН 6,9- 7,3.5Хорошо спорулирующую агаровую"куль- туру штамма смешивают с 5 мл стерильного, 0,9-ного раствора поваренной соли, что дает густую суспензию спор;)О Из этой суспензии спор 1 мл применяют для инфицирования колбы Эрлен- мейера емкостью 500 мл, которая содержит 100 мл следующей среды предварительной культуры, г/л 1 5Рйцгвсцпейа 25,0Церелоза (глюкоза) 25,0дистиллйрованная(среда 1 )вода 1 лРН 6,5-6,8 Ю Среду предварительной культуры стери-лизуют в автоклаве при температуре120 С в течение 20 мин, РН 6,7-7,2. После этого предварительную культуру аэробно инкубируют в течение трех дней при температуре 27 С и затем применяют для инфицирования основной культуры. Для этого 5 мл предварительной культуры помещают в колбу Эрленмейера емкостью 500 мл со 100 мл следующей среды, г/л: 30 Сахароза 20,0Пептон 2,0Солодовый экстРакт 2,0дрожжевой экстракт 2,0 (среда В )КН РО,2,0Ив 0 е 7)(хО 2,0Дйстиллированнаявода 1 лРН 6,8-7,2 устанавливают с помощьв ЙаОН.ОснОВЯУю культуру инкубируюттечение 6 дней нри 27 фС на круговойкачалке при 200 об/мин,45П р и м е р 2. Культуру штамма йгер 1 отпсез пвФаЬЖь (чИЬ, 8088 получают путем выращивания в течение 10 дней при температуре 27 фС на сре-, де П 1 Споры и мицелий этой культуры обрабатывают я физиологическом растворе поваренной соли. С помощью этой сусцензии заражают 1 л следующей среды, г/л: Растворимый крахмалГлюкозаМука соевых бобовСогп МеерПолипептОнНосЕСасбдистиллированнаяЗОДВ 30,0 20,0 10,0 10,0 5,0 3,0 5,0 РН 7,0 устанавливают с помощьюМаОН.Эту предварительную культуру инкубируют в течение 3 дней при температуре 27 С на круговой качалке при 180 об/мин, ).0 л питательной среды Ц заражают предварительной культурой и инкубируют в стеклянном ферментере "при перемешивании при 200 об/мин и аэрации воздуха 1 л/мин в течение 5 дней при температуре 27 С.П р и м е р 3. Выделение натриевой соли антибиотика 100 л культурального бульона полученного по примеру 1 и 2, центрифугируют,. причем выделяется примерно 90 л фильтрата культуры и примерно 6 кг мицелия. В культуральном фильтрате устанавливают РН 9 с помощью 1 н.раствора гидроокиси натрия и Фильтруют до прозрачности через вспомогательные фильтры. Фильтрат при температуре 20 С трижды экстрагируют этилацетатом и экстракты промывают 15 л воды.После выпаривания органической Фазы в вакууме при температуре 20- 40 С выпадает примерно )6 г сырого экстракта.Мицелий экстрагируют сначала 12 л метанола, затем дважды по 12 л смеси метанол: вода - 9:1 в течениео1 ч при 20-25 С при одновременной гойогенизации. Материал клеток затем отфильтровывают.К фильтрату добавляют 5 л воды, выпаривают в вакууме при температуре 20-40 С до объема 3 л с помощью 1 н.раствора гидроокиси натрия устанавливают РН 9, Трижды экстрагируют по 3 л этилацетатом, экстракты промывают 1,5 л воды и органические фазы выпаривают в вакууме при температуре 20-40"С, Выделяется 9,4 г экстракта. Оба экстракта объединяют, обрабатывают 500 мл воды и экстрагируют трижды по 250 мл толуола. Толуольную фазу промывают один раз 100 мл воды, высушивают над сульфатом натрия и выпаривают в вакууме при температуре 40 С. Выделяется 11 г желтого, маслянистого остатка. Этот остаток хроматографируют на силикагеле 60 МеЪ с величиной зерен 0,06-0,2 мм. Используют смесь толуол-ацетон 98:2 +1% триэтиламина. Элюирование смесью толуол:ацетон - 98:2 +1% триэтиламина и смесью толуол:ацетон 9:1 +1 триэтиламина дает преимущественно неактивные примеси (сопутствующие вещества). С помощью смеси толуол:ацетон - 4:1 и толуолацетон - 1:1 при добавке 1 тризтиламина элюируется ан"ибиотик в обогащенной Форме. Фракции выпаривают в вакууме при температуре 20-400 С н остаток хроматографируют на содержание антибиотика Б 11743/А. Активные Фракции объединяют и снова хроматографируют не 40-кратном количестве смликаб 43085 дважды по 40 мл с 2 н.соляной кислотой и промывают 40 мл воды, Органическую фазу со свободной кислотой антибиотика б 11743/А встряхивают (дважды по 40 мл) с 2 н. КОН и один раз промывают 40 мл воды. ХлороФормную фазу высушивают над твердым карбонатом калия и после фильтрования выпаривают в вакууме. Остаток растворяют в 2 мл метанола и Фильтруют через тальк. Через 4 ч кристаллизат отфильтровывают и перекристаллизовывают из 2 мл кипящего метанолаПосле стояния в течение ночи отфильтровывают и остаток высушивают в вакууме при температуре 404 С в течение 1 ч. Получают бесцветные кристаллы калиевой соли с т.пл. 158-1 б 0 С.Предлагаейый антибноти обладает антибиотической активностью против таких микроорганизмов, как грамположительные бактерии и грибы. Формула изобретения 1. Способ получения антибиотика Формулы Н Н Н СНА Кн2Способ щ и й с я т ма осущвствл содержащей д менты; Составитель С.ИалютинаТехред М.Петко Корре еда мельяно-ЬФилиал ППП Патент 1 , г.ужгод Ул,Проектна геля, причем применяют хлороформ сувелйченным содержанием метанола дляэлюирования. Смесью хлороформ:метанол 98:2 злюируют антибиотик, 11743/Ав"сильно обогащенной форме. Послевыпаривания активных Фракций в вакууме при температуре 20-40 С светло желтый остаток растворяют в хлороФорме, один раз встряхиваюг с 1 н.раствором едкого натра, органическиефазы промывают водой, выпаривают ввакууме и остаток кристаллизуют из1,5-кратного количзства ацетона. Выделяется натриевая сбль антибиотика11743/А в виде бесцветных, содеРжащихацетон кристаллов с т.пл. 159-163 С,Для удаления кристаллизационного ацетона многократно обрабатывают в вакууме бензолом и затем .метанолом.Аморфную, чистую натриевую сольантибиотика11743/А высушивают в.вакууме при температуре 60 С и затемплавят при 1 ббС, 20Л р и м е р 4. Калиевая соль антибиотика 6 11743/А. 280 мгнатриевойсоли антибиотика 11743/А растворяютв 40 мл хлороформа и встряхивают о т л и ч а ю щ и й с я тем, чтоштамм Ыгер 1 овсез що 1 аЬИ 1 з ЙЮЬ 8088выращивают на питательной среде,содер.аащей источники азота, углерода и минеральные соли с последующим выделением целевого продукта в виде кислоты 4или соли по п,1 о т л и ч а ю м, что выращивание штамют на питательнои срезай; волнительно микроэле