Способ получения цеаксантина

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК ПАТЕНТУ рп 558649 Союз СоветскихСоциалистическихРеспубликГосударственный комитетСовета Министров СССРпо делам изобретенийи открытий 31) 10903/73 53) УДК 547.979,8(088.8) Опубликовано 15,05.77,Дата опубликования оп 2) Авторы изобретени Иностранеферд и Я (Швейцар странная Продюи(Швейцар Дав Дасе рославия)фирмаНестлия) 1) Заявител Ино Сосьете деЦЕАКСАНТИ НА 54) СПОС ЛУ бразом пиулюм мик- Процесс Изобретение относится к способам получения цеаксантина путем микробиологического синтеза.Желтый пигмент, называемый цеаксантином или 3,3-Р-диоксикаротином, может быть использован в качестве кормовой добавки для кур для усиления желтой окраски их кожи или желтка яиц, Изучается возможность использования этого вещества в качестве красителя в косметической и пищевой промышленности.Известен способ получения цеаксантина, включающий культивирование его продуцентов микроорганизмов из рода Р 1 ачоЬасег на жидкой питательной среде, содержащей источники усвояемого углерода, свободные аминокислоты, минеральные соли, микроэлементы и витамины 11.Однако процесс получения этих пигментов путем биосинтеза микроорганизмами является сложным, зачастую характеризуется очень низким выходом при значительном расходе питательной среды,Для повышения выхода цеаксантина по предлагаемому способу в питательную среду перед культивированием микроорганизмов дополнительно вводят свободные серусодержащие аминокислоты, например цистин, цистеин или метионин, до величины не более 1 мг/мг среды, и микроэлементы в виде ионов двухвалентных металлов 1 е, Со, Мо, Мп в концентрации, равной 0,001 в ,1 м.5 Предлагаемый способ позволяет значительно повысить выход цеаксантпна, в отдельных случаях - в четыре раза по сравненшо с известным, благодаря чему снижаются издержки производства.О Для осуществления предлагаемого способасначала готовят питательную среду, в которой в качестве источника асспмилируемого углерода используют 0,1 - 15% глюкозы плп сахарозы от веса культуральной среды, в ка честве ассимилируемого а минного азота -0,1 - 8% от веса среды дрожжевого или кукурузного экстракта или же гидролизата белков отвеса среды. В среду вводят также 0,1 - 2% сульфата магния. Эти вещества разводят 0 водопроводной водой до 100 вес. % .Состав аминокислот в среде изменяют добавлением метионпна, цистина или цистеина, доводя их содержание предпочтительно до 3 - 10% относительно количества других ами нокислот.Затем в приготовленный таким отательный раствор добавляют инокроорганпзмов из рода гаоЬас 1 ег15 ферментации осуществляют при постоянном перемешивании и аэрации при соответствующем значепии рН, температуре и времени, необходим для получсния значительного количества внутриклеточного цеаксантина,Затем питательную среду высушивают, в случае необходимости после концентрирования экстрагируют клеточный цеаксантин с помощью полярного органического растворителя, такого как ацетон, этиловый спирт, или хлористого растворителя, например хлороформа, Затем отделяют биомассу от культу- ральной среды путем центрифугирования, декантации или фильтрации, Биомассу можно использовать, например в качестве кормовой добавки для кур, или же ее экстрагируют полярным органическим растворителем.Концентрация цсаксантина в биомассе при полученииего таким образом возрастает примерно до 50% по сравнению с концентрацией в культуре такого же микроорганизма, получаемого на классической среде. Увеличение выхода цеаксантина не является следствием увеличения абсолютного количества метионина и/или цистина, и/или цистеина в основном питательном растворе, а это - сравнительное количество по отношению к количеству аминокислот, имеющихся в основном питательном растворе или питатсльной среде.Однако количестго метиоина и/или цистина и/или цистепна, добавляемого в среду, ограничивают до величины пе более 1 мг/мл, так как большие количестпа обладают ингибпрующим действием,Такое же действие отмечается при добавлении в основной питательный раствор микроэлементов, например в виде ионов двухвалентных металлов Ре, Со, Мо, Мп, без добавления указанных серусодержащих аминокислот, что приводит к увеличению концентрации цеаксантина в биомассе до 50/, и одновременно к увеличению биомассы также до 50%,то есть производство цеаксантина возрастает вдвое по сравнению с известным способом культивирования микроорганизма на классической питательной среде.Состав микроэлементов среды изменяют введением ионов таких двухвалентных металлов, как Ре+ф, Со"-, Мо, Мп, вводят их в ограниченных количествах, не превышающих 0,1 М, во избежание проявления явления ингибирования. Ионы указанных металлов вводят в количестве 0,0005 - 0,1 М. Оптимальное их количество 0,001 - 0,05 М. Ионы металлов вводят в виде таких хорошо растворимых солей, как, например, сульфат железа или хлористое железо, хлористый кобальт, молибдат натрия и сульфат магния. Предпочтительной аминокислотой для среды является метионин и предпочтительным ионом металла является ион Ре.При одновременном введении приведенных выше серусодержащих аминокислот и указанных ионов металлов наблюдается явление синергизма, благодаря чему продукция це 20 25 зо 35 40 45 50 55 ао 65 аксантина может быть увеличена в четыре раза по сравнению с известным способом культивирования этого микроорганизма на классическом питательном растворе. Увеличение производства цеаксантина происходит вследствие увеличения в три раза концентрации цеаксантина в биомассе по сравнению с увеличением количества самой биомассы.П р и м е р 1. Готовят культуральную среду, следующего состава; вес, %:Глюкоза 3 Гидролизат казеина (триптон) 1 Дрожжевой экстракт 1 Сульфат магния 0,5 Вода водопроводная До 100.Среду помещают во флакон, стерилизуют при 120 С в течение 20 мин, затем охлаждают до 25 С, рН среды после стерилизации устанавливают 7,3. В среду вводят инокулюм мутанта штамма АТСС Ко 21588 из рода Р 1 а оЬас 1 ег. Культура этого микроорганизма выдерживается на указанной среде в течение 48 ч при температуре 25 С, среда постоянно а-рируется поворачиванием флаконов на соответствующих аппаратах. После окончания процесса культивирования флаконы центрифугируют и собирают клеточную массу, которая составляет 10.,5 г искомого вещества на 1 л питательной среды,Количество цеаксантина, содержащегося в клетках, определяют экстракцией пигмента и последующим измерением оптической плотности экстракта. Для получения экстракта приготовляют суспензию клеток в 5 мл водного солевого раствора, затем добавляют равный объем ацетона, встряхивают несколько минут и фильтруют. Оптическую плотность фильтрата определяют на спектрофотометре при длине волны 450 нм, Количество цеаксантина определяют сравнением полученной оптической плотности со стандартной кривой, полученной измерением оптической плотности нескольких разведений, содержащих различные количества чистого цеаксантина.Такой способ экстракции и измерения применяют для большого количества образцов подобной культуры, Выводят среднее арифметическое полученных численных результатов. Количество цеаксантина, содержащегося в клетка.;, или специфическую концентрацию также определяют, исходя из 5,16 мг на 1 г клеточной массы, что составляет получение цеаксантина в количестве 54,2 мг на 1 мл питательной среды. Точность этой оценки составляет около .+ 3 - 5/оВ таблице приведено несколько примеров зависимости выхода цеаксантина от вида и количества добавляемого в культуральную среду вещества. Количества даны в г для соответствующей аминокислоты на 1 л среды и в молярпой концентрации для соответствующего иона в среде.Последовательность операций во всех примерах такая же, как в примере 1. Добавление в среду серусодержащих аминокислот558649 5и/или ионов двухвалентных металлов осуществляют непосредственно перед введением в нее инокулюма или перед стерилизацией среды. Числовые выражения продукции клеточной массы и цеаксантина приводятся с точностью до .+ 3 - 5%. Они представляют собой среднее арифметическое значений, определенных для трех из десяти образцов данной культуры.В последних примерах несколько изменен состав основной среды и природы инокулюма с тем, чтобы подтвердить, что эффективность способа зависит не от конкретного состава среды или одного удачно подобранного му танта. Так, например, в примере 20 основнаясреда содержит 2% дрожжевого экстракта и 1% триптона, в примере 21 - 1% дрожжевого экстракта и 2% триптона и в примере 22 используемый мутант не такой, как в других 10 примерах. Количество добавляемого веществамкг/мл 0,06 0,12 0,24 0,48 0,12 0,12 Мети онин Метионин Метионин 0,0020,010,0010,0020,002 МетионинРе0,12 0,002 Мети онинРе0,12 9,6 14 188 19,5 0,01 0,12 ЦистеинРе15 13,9 10,8 151, 4 0,002 ЦистинРе0,12 14,0 16 143,2 10,3 0,002 МетионинРе0,12 17 14,8 9,8 146,4 0,002 0,12 МетионинСо11,6 18 131,1 11,3 0,001 0,12 ЦистинМп + 12 19 134,6 10,6 0,002 0,12 МетионинРе20 156,4 11,67 13,4 0,002 МетионинРе0,12 13,2 21 165,0 12,5 0,002 0,12 22 168,0 12,7 МетионинРе13,2 0,002 Формула изобретения минеральные соли, микроэлементы и витамины, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода цеаксантина, в питательную среду перед культивированием микроорганиз мов дополнительно вводят серусодержащиеаминокислоты, например цистш, цистеин или метионин, в количестве не более 1 мг/мл среСпособ получения цеаксантина, включающий культивирование продуцентов его микроорганизмов из рода Р 1 ачоЬас 1 ег на жидкой питательной среде, содержащей источники усвояемого углерода, свободные аминокислоты,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Метионин Цистин Цистеин Ре ф+ РеСоМо Мп 54,2 65,8 77,0 72,0 50,3 71,4 73,0 118,8 124,4 91,4 88,0 86,0 168 10,5 10,7 8,3 7,6 6,1 11,5 10,8 14,5 13,8 9,9 10,5 11,6 11,6 5,16 6,14 9,27 9,47 8,24 6,2 6,75 8,19 9,01 9,23 8,38 7,41 14,48Корректор О. Тюрина Редактор И, Селищева Заказ 116418 Изд.431 Тираж 560 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Типография, пр, Сапунова, 2 ды и микроэлементы в виде ионов двухвалентных металлов г е, Со, Мо, Мп в концентрации, равной 0,001 в ,1 М. 8Источник информации, принятый во внимание при экспертизе:1. Патент Франции2099367, С 216 5/00, 1972.