Способ получения адсорбентов для хроматографии

(в количестве 1-5 функциональных группна 100 моносахаридныхостатков), с последукицим присоединением лиганда путемпредварительной активации полисахариднойвставки с помощью бромнстого цииана, периодатного окисления или других известныхметодов.Способ позволяетполучать устойчивыебиоспецифнчес 1 сие адсорбенты с высоким содержанием лиганда, Так, во всех случаяхсодержание лиганда на 1 мл адсорбента сполисахаридной вставкой примерно в 3 раза превышало .содержание лиганда в анаогичньгх адсорбентах без вставки, В качестве носителей, наряду с агароэой, могут быть использованы производные полиакрнламида, шарики иэ.пористого стекла ндругие. Биоспецифнчность полученных адсорбентов обусловливается гидрофильной,/инертной природой полисахаридной вставки,1,ие несущей каких-либо гидрофобных или эа"ряженных групп.Для активации вставки 1 применяютсядостаточно простые и хорошо разработанные методы, что позволяет присоединятьк носителю как низкомолекулярные лнган-.ды, относящиеся к различным классам органических соединений, так и белковые. ли;ганды. В последнем случае предлагаемыйспособ может быть использован и для иммобилизации ферментов,П р и м е р 1. Получение биоспецифического адсорбента РНК-азадекстрансефароэа (РНКаэа - рибонуклеаза),А. Введение вставки в носитель декстрансефарозаф.К раствору 0,5 г карбокснметилдексграна (мол. вес 40000, степень замещения карбоксиметильными группами Т =5на 100,ангидроглюкозныых единиц) в 6 млводы добавляют 6 мл (упакованный объем)аллиноэтилсефарозы, содержащей 5 О. экв,, КНй-групп на 1 мл геля. РН смеси доводят до 4,7-5 с помощью 1 н, НС 1 и пос-тепенно добавляют раствор 20 мг хлоргидрата 1-этип/3-димегиламннопропил/-карбодиимида (ЭДК) в 3 мл воды. Реакциононую смесь перемешивают 48 час при 20 Ся,поддерживая в течение первого часа 1 т Н4,7-5 с помощью 1 н, НС Затем сефЬрозу отделяют, промывают водой (100 мл)0 1 М ЙаНСО (100 мп) и вновь водой3(100 мл) . Юля блокирования остаточныхсвободных ЙН-групп суспенэию декстран.сефароэы в 6 мл воды пере: ешивают 6 часпрн 20 С с 0,02 мл ледяной уксусной кисолоты и 2 мг ЗДК, промывают 1 л воды ииспользуют в следующей стадии. 37 О 4Б. Присоединение лиганда: РНК- азадек.странсефароэа,К суспензия 5,5 мл декстрансефарозыа 5,5 мл натрийцосфатного буферного раст;вора, рН 6, постепенно добавляют 130 мгпериодата наточин, и смесь перемешивают1 час при 20 С, Активированный гель промывают 100 мл воды и смешивают с расФвором 40 мг РНК-аэы в 10 мл 0,1 Мр ИОНСОЗ, содержащего 0,5 М ИаСС. Смесьоперемешивают 20 час при 20 С, затем постепенно добавляют свежеприготовленныйраствор 100 мг боргидрата натрия в 5 мловоды и перемешивают 1 час при 20 С. Йолученный биоспецифический адсорбент отделяют, промывают на пористом фильтре 250Мл 0,1 М ИюНСО + 0,5 М ИФС, затем пь,ВО мл 0,1 М ацетатного буферного раствора + 1 М ИаС. (рН 4) и 0,1 М боратногоу буферного раствора + 1 М ИаС 1, (рН 8)(последние две промывки повторяют трижйы)По данным спектрафотометрического анализа и определения РНК-азной активностиисходного белкового раствора и промывныхвод, после присоединения белка содержаниеРНК-аэы в адсорбенте составляет 6 мг/млобъема упакомнного.геля. Содержание РНКазы в адсорбенте полученном, прямым при"соединением фермента к СИВО- активированной сефароэе не превышает 2-2,5 мг/млобмма упакованного геля. Адсорбент может храниться длительное время при 4 Св виде водной суспензия в присутствии0,02% аэида натрия.П р и м е р 2 Получение биоспеци,Вфнческого адсорбента РНК-азаамилопектинФсефароза".Адсорбент получают по методике, описаиной в примере 1, исходя иэ карбоксиме 4 Етипового эфира амилопектина и аминоэтилсефарозы. По данным спектрофотометрического анализа и оппределения РНК-аэной активности, удельное содержание фермента вадсорбенте 6,5 мг/мл объема упакованнощгеля,П р и м е р 3, Получение биоспецифического адсорбента гемоглобин-декстраи-. сефароэа,А. Получение модифицированного декс-ВЭтрана - "этилендиамннокарбоксиметипдекстранК охлажденному до 4 С раствору 2 гкарбокснметилдекстрана (мол, вес 40000,Г) в 6 мл воды постепенно приливают1,48 мл 50%-ного раствора этилендиами ,на в воде, 2 мл воды и 5 млпиридина. Краствору добавляют при перемешивании1,91 г дициклогексилкарбодиимида в 5 млпиридина, Реакционную смесь перемешиовают 48 час при 20 С, разбавляют 3объемами воды осадок отделяют, фильтратобрабатывают эфиром (3 х 30 мл), водный слой унериваю; Остаток растворяютв 20 мл воды и вводит в колонку ( Ч а100 ми) сефадексаФ ж 50 вода), Фрак- бции, вьпсодяиие с исключавшимся объемом,,объединике, упарииавт до 30 мл, подшелачивавт до рй 8-9; и полимер высажимют 2 объемами спирта, Осадок отделяют,растирайт со, спиртом, затем с асолютным рфо" аС неремешивают 16 час при 4 С с150 мг атилеядиаминокарбоксиметилдекстрана,( 3 щ 5), Затем сефарозу промывают на пористом фильтре водой 50 мл),0,1 М апетатным буферным раствором(рН 4) (50 мп) и водой (110 мл). Соъласно определению содержания азота впромывных водах (по Кьельдалю) с сефа,розой коваленко связывается 114 мг(7 РЦ производиого декстра а.Пля блокирования оставшихся активных Егрупп на сефарозе промытый гель перемео,;кивают 2 час при 20 С с двумя объемами1 М этаноламина при:рН 8, а" для блокировании И Н-груип на полисахариднойвставке, не вступивших в реакцию с СНВгактивированной сефарозой, суспензию геляов .воде перемешивают 6 час при 20 С с0,02 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мг"ЗДК. После промывки водой (100 мл) декстрансефарозу используют в следующей ста дии,В. Присоединение лиганда "гемоглобиндекстрансефароза". оК охлажденной до 4 С суспензии 7 мл,ляютпри перемешивании 7 мл 2 М раство-ра Нй СО и затем 0,35 мл раствора бро 2. змистого циана в ацетонитриле (2 г СЙВ млМеСЙ) . Взвесь энергично перемешивают 2 мин,выливают на пористый фильтр, быстропромывают 0,1 М ЙаНСОз, водой и 0,1 МЙаНСОз + 0,5 М ЙаС 1 (по 100 мл). За-,,тем активированный гель смешивают с раствором 40 мг гемоглобина в 8 мл О, 1 МаНСО .+ 0,5 М ЙаС 1, и смесь перемеши/зовают 20 час при 4 С. Промывание биоспецифического адсорбента проводят, как описано в примере 1 Б,Согласно спектрофотометрическому аийлизу (при280 и 400 нм) адсорбент содержит 6,2 мг белка/мл упакованного гелй.Лдсорбент, полученный прямым присоедиие:нием гемоглобина к СИ В-активированнойсефарозе, содержит 1,5 мг белка/мл геЛя,Темно-коричневый адсорбент хранят прй"о4 С в воде в присутствии 0,02% азиданатрия.П р и м е р 4, Получение биосйеци-.фического адсорбента "поли 9 -гликогеибиогель марки Р" (поли 1) -полиуридиловая кислота).А. Введение вставки в носитель "гликогенбиогель Р".Присоединение 0,5 г карбоксиметилгли"когена (-5) к 5 мл аминоэтилбиогелиРпроводили, как описано в примере1 А с помощью водорастворимого карбодиим яда.Б. Присоединение лиганда "поли 0 -гликогенбиогель Р",К перемешиваемой суспензия 5 мл гликогенбиогеля Р-ЗОО, полученной в примере 4 А, в 10 мл смеси вода - 2 М ЙаоСО( 1: 1) добавляют при охлаждении (4 С)0,3 мл раствора бромистого циана в ацетонитриле (2 г СЙ Вр / мл МеС Й). Вмомент присоединения бромистого циананаблюдается слипание шариков биогеля.Смесь энергично перемешивают 1,5 мин ифильтруют, гель промывают на пористомфильтре 0,1 М ЙаНСОзводой и 0,1 МЙаНСО + 0,5 М ЙаС 1 (по 75 мл), Про-мытый гель вносят в раствор 6 мг поли 3в 7 мл 0,1 М натрийфосфатного буферйо 1 ораствора (рН 7,5), и смесь перемешивают16 час при 4 С.Полученный адсорбент промывают 50 мл " 0,1 М натрнйфосфатного буферного раствора и перемешивают 2 час с равным объемом 1 М этаноламина (рН 8/ для бло кировання остаточных активных групп на полисахаридной вставке. Затем адсорбент 1промывают 50 мл 90%-ного фор;ламида в 10 мМ калийфосфатного буферного раствора (рН 7 5) содержащего 110 мМ ЭДТА и 02%додецилсульфата и 50 мл 25%-ного формамида в 50 мМ трнс-НСВ: буфер- його раствора (рН 7,5), содержащего 10 мМ ЭДТА и 0,7 М ЙаС.Количество присоединенного 1 полиО определяют по адсорбцни ппи260 нм исходного раствора полинуклестида и про.мывных вод, Согласно спектрофотометри ческому анализу, удельное содержание лиганда составляет 536 мг/мл адсорбента.оФормула изобретения Способ получения адсорбентов для кроматографнн путем присоединения лнганда к носителю через вставку, о т л н ч аю ш и й с я тем, что, с пелью уйрошения процесса присоединения лнганда, повышения удельного содержания диганпав адсорбенте и улучшения биоспепнфнчности 5203708дсорбента, носитель подвергают взаимоаействию с инертными водорастворимыми Жаисахаридами, содержащими функпиональ ные группы в количестве 1-5 на 100 мо носахаридных остатков, обеспечивающие ковалентное связывание с носителем, с последующим присоединением лигандов пу тем предварительной активации полисакаридной вставки.Составитель С. Вююхина .Редактор Л. Ушакова . Техред.С, Габовда Корректор Б, Югас,Заказ 2885/196 Тираж 629 Подписное11 НИИПИ Госудврственного комитета Совета Министров СССРпо делам изобретений и открытий13.3035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП Патент г. Ужгород, ул, Проектная, 4