Способ определения мутагенной активности донных отложений

) Я 3 (11) 1835924 3) А 1 1) 6 б 01 Х 332 Российской Федерациитам и товарным знакам мит по па(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 22) 25.09.90 ИЯ МУТАГЕН НЫХ ОТЛОЖ кая токсиколоотложений на зобретения: на ные отложения предварительно с экстрагентом честве экстраор твинаМ торскому свидетельству(56) Цыбань А.В Лычева Г,А ШирокаяЕ,Е, Изучение загрязнения морской средыпутем определения мутагенной активностидонных отложений, - "Эксперим. онкология", 1987, т, 9, М 5, с,27-29. Цыбань А,ВЛычева Г.А., Широкая Е,Е, Изучениезагрязнения морской среды путем определения мутагенной активности донных отложений. - "Эксперим, онкология", 1987, т, 9,М 5, с.27-31.(54) СПОСОБ ОНОЙ АКТИВНО ДНИЙ(57) Использование: генетичгия, исследование донныхмутагенность. Сущность имутагенную активность донисследуют в тексте Эйлиса,отбирают пробы, смешиваюти отстаивают суспензию, вгента используют 10% растэтаноле. 1 табл.18 Изобретение относится к генетической токсикологии и может быть использовано при исследовании донных отложений на мутагенность.Способ осуществляется следующим образом.Проводят отбор проб донных отложений, Далее берут 5 г (сырой вес) донных отложений, добавляют 10 мл смеси твин/этанол в соотношении 1:10 и перемешивают на магнитной мешалке. Потом отбирают жидкую фазу и исследуют в тесте Эймса.В пробирку с 0,6полуобогащенным агаром вносят 0,1 мл суспензии бактерий, например, Ба 1 шопе 11 з 1 урЫшипцш (штаммы ТА 100 и ТА 98) и 0,1 мл используемого образца, Тщательно перемешивают и выливают на чашку Петри со средой М 56. При использовании метаболической активации в пробирку дополнительно вносят 0,5 мл микросомальной активирующей смеси следующего состава на 1 мл: 0,3 мл микросомального супернатанта (используют, например, Бфракцию печени крыс производства института экологии и генетики микроорганизмов АН СССР, г.Пермь, активированную сов олом) 0,7 мл 0,2 М калийфосфатно го буфера, содержащего 4 мМ НАДФ, 5 мМ глюкозо-б-фосфата, 33 мМ КС 1, 8 мМ МяС 1После застывания агара чашки помещают в термостат и инкубируют при 37 С 48 ч,Учет результатов производят по индукции реверсий от ауксотрофности по гистидину к прототрофности. Сравнивают число колоний - ревертантов на опытных и контрольных чашках,Мутагенную активность (МА) выражают индексами, Отсутствие мутагенной активности регистрируют в том случае, если количество колоний в опыте и контроле не различается более, чем в два раза. Если число колоний в опыте в 2-10 раз больше, чем в контроле, то МА считают слабой (1 балл "+"), в 10-100 раз - средней (2 балла ), свыше 100 - сильной (3 балла ),Примеры конкретного выполнения.П р и м е р 1. Пробы донных отложений отбирали в нескольких точках дельты р,Дон с помощью дночерпателя, Четыре пробы по 5 г донных отложений (сырой вес, сухой вес определяли параллельно) в каждой помещали в бюкс обьемом 100 мл, добавляли 10 мл 10 (объем/объем) раствора твинав этаноле и 30 мин интенсивно перемешивали на магнитной мешалке. После отстаивания суспензии отбирали жидкую фазу и исследовали на мутагенность в тексте Эймса,35924 4приведенном выше. Время экстракции - 30мин,Для сравнения эффективности экстракции мутагенов раствором твинв этанолпроводили экстракцию тех же проб сиспользованием смеси ацетон-гексан.Экстракцию поводили из 5 г донныхотложений двумя порциями по 50 млацетон-гексановой смеси (1:2), Время экстракции 90 мин. Полученный экстрактвыпаривали до 1 мл на песчаной бане ипереводили в ДМСО.Полученные экстракты исследовали намутагенность в тесте Эймса.Таким образом, результаты по мутагенной активности для каждого образца представлены в таблице в четырех вариантах:для штамма ТА 98 с метаболическойактивацией (варианты 3, 7, 11, 15);для штамма ТА 98 без метаболическойактивации (4, 8, 12, 16);для штамма ТА 100 с метаболическойактивацией (1, 5, 9, 13);для штамма ТА 100 без метаболическойактивации (2, 6, 10, 14).В каждом варианте представлены количественные и качественные (баллы) данныедля каждого из двух вариантов экстракции.Как видно из таблицы, при использовании в качестве экстрагента 10(обьем/объем) раствора твинав этаноле (А)мутагенная активность (МА), обусловленнаяналичием генотоксикантов косвенного действия, была зарегистрирована во всех пробахдля штаммов ТА 98 и ТА 100 (варианты 1,3, 5, 7, 9, 11, 13, 15),МА, обусловленная наличием генотоксикантов прямого действия, была зарегистрирована только для штамма ТА 98 (варианты4, 8, 12, 16),При использовании в качестве экстрагента смеси ацетон-гексан,МА была зарегистрирована в трех пробах,причем для штамма ТА 100 в пробе Х 1(вариант 2) МА обусловлена наличиемгенотоксикантов прямого действия в пробе И3 (вариант 9) - генотоксикантов косвенногодействия, для штамма ТА 98 наличиемгенотоксикантов косвенного действия в пробеХ 4 (вариант 15).Таким образом, при использовании предложенного способа МА была зарегистрирована в 12 вариантах иэ 16 (варианты 1, 3, 4,5, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 15, 16).В том числе зарегистрированы генотоксиканты, действующие по типу:1, "Сдвиг рамки считывания",1,1 прямого действия - в четырех пробах835924 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 5 11.2 косвенного действия в четырех пробах (варианты 3, 7, 11, 15),2, "Замена пар оснований",2,1 прямого действия - не зарегистрировано:2,2 косвенного действия - в четырех пробах (варианты 1, 5, 9, 13),При использовании способа прототипа (В) МА зарегистрирована в трех вариантах из 16 (варианты 2, 9, 15), в том числе генотоксиканты, действующие по типу:1,"Сдвиг рамки считывания".1,1 прямого действия - не зарегистрировано (варианты 4, 8, 12, 16).1,2 косвенного действия - в одной пробе (вариант 15),2, "Замена пар оснований",2,1 прямого действия - в одной пробе (вариант 2); Способ определения мутагенной активности донных отложений, включающий отбор пробы, смешивание с экстрагентом, отстаивание суспензии и исследование жидкой фракции на мута генную активность при помощи бактериальной тест-системы, отли 2,2 косвенного действия - в одной пробе (вариант 9),При сравнении количественных данных оказалось, что во всех вариантах, кроме одного (вариант 2) наблюдалось увеличение эффекта при использовании предложенного способа по сравнению с прототипом,Таким образом, использование в качестве экстрагента 10(объем/объем) раствора твинав этаноле позволяет значительно повысить эффективность определения мутагенной активности донных отложений за счет повышения достоверности результатов анализа, а также сокращения времени экстракции и улучшения условия труда исследователя, достигаемого за счет замены токсичных растворителей этанолом,чающийся тем, что, с целью повышения эффективности извлечения мутагенов, сокращения времени экстракции и улучшения условий труда, в качестве экстрагента используют 100 (объем/объем) раствор твинав этаноле.