Способ обнаружения веществ с цитокининовой активностью

)56 01 И 33/534 й 65 ГОСУДАРСТВЕННОЕ ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) НТНОЕ ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ АТЕН(71) Институт физиологии растений им. К,А,Тимирязева(72) Г.А.Романов, В,Я,Тар, Э.М.Оруджев, О.Н.Кулаева, Ф,А.Бровко и В,М,Липкин (73) Коммерческо-финансовая фирма "РЭН" (56) 1, Кулаева О.Н. Цитокинины, их структура и функция. - М,; Наука, 1973, с. 222 - 223.2. Там же, с. 223-224.3. Кудоярова Г,РВеселов С.Ю Каравайко Н.Н, и др, Иммуноферментная тест- система для определения цитокининов. - Физиология растений, 1989, т, 37, с. 80 - 89,Изобретение относится к биотехнологии и регуляции роста растений и может быть использовано для выявления веществ, обладающих цитокининовой активностью, необходимых для практики современного растениеводства и для научных исследований.Целью изобретения является повыше. ние чувствительности и объективности, а также сокращение длительности и трудоемкости испытаний веществ на цитокининовую активность.Поставленная цель достигается тем, что в известном способе, включающем воздействие испытуемого вещества на тест-объект в виде целых растений или их изолированных органов и последующую оценку результата по сравнению с контролем, в качестве тест-объекта используют определенное количество фракции растворимых белков иэ вегетативных органов злаков в смеси с ме(54) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ВЕЩЕСТВ С ЦИТОКИНИНОВОЙ АКТИВНОСТЬЮ (57) Использование: биотехнология, регуляция роста растений, выявление веществ, обладающих цитокининовой активностью. Сущность изобретения; воздействуют испытуемым веществом на тест-объект, определяют цитокининэависимый параметр по сравнению с контролем. В качестве тест- объекта используют фракцию выделенных из растений злаков предварительно очищенных водорастворимых белков в количестве 0,02-0,5 мг/тест в смеси с высокомечеными цитокининами с радиоактивностью 10000 - 100000 расп/мин на тест, 1 табл., 1 ил. ченым цитокинином, в соотношении 100 - 1000 расп/мин радиоактивности гормона на 1 мкг белка, Для воздействия испытуемого вещества на тест-объектдостаточно 5 мин при 0 - 20 С и рН 6 - 9. Оценку эффекта ведут по содержанию меченого цитокинина, ассоциированного с белками, после их выделения иэ тест-системы по сравнению с контролем. Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый способ отличается от известного использованием в качестве тест-системы фракции растворимых белков злаков, обладающей способностью специфически взаимодействовать с цитокининами, В научно-технической и патентной литературе, посвященной поиску новых цитокининов, этот признак ранее не описан. Таким образом, заявляемый способ соответствует критерию "новизна". Что касается антител, используемых для иммунологического определениясодержания эндогенных цитокининов, то они обладают узкой специфичностью и интенсивно взаимодействуют лишь с тем соединением (и его близким аналогом), против которого они были выработаны (3), Поэтому тест-система на основе антител не подходит для обнаружения новых веществ с цитокининовой активностью,Фракция природных белков из вегетативных частей злаков обладает необходимыми свойствами, позволяющими создать на ее основе тест-систему для поиска новых цитокининов. Во-первых, эти белки взаимодействуют с широким спектром различных цитокининов, включая цитокинины как аденинового ряда, так и производные дифенилмочевины, Во-вторых, указанные белки отличаются высокой стабильностью и не меняют своих свойств по ходу очистки и в процессе тестирования. Полученная белковая. фракция может длительно храниться без изменения основных характеристик в соответствующих условиях, например, в замороженном растворе при (-29)+70)С, в виде осадка в растворе 75 - 80)ь от насыщения сульфата аммония при температуре от 0 С и ниже, а также в лиофильно высушенном виде.Заявленный способ осуществляют следующим образом, Для получения тест- объекта смешивают в любой последовательности микрообьемы препарата белка в количестве 0,02 - 0,50 мг на тест с 0,2 - 5,0 пикомолями высокомеченого цитокинина с удельной радиоактивностью не ниже 100 ГБк/моль, для получения нужного количества радиоактивности в пробе, Затем к пробам добавляют испытуемое вещество и в качестве одного из наиболее удобных осадителей белка сульфат аммония до конечной концентрации 2,5 - 3,5 М, перемешивают, выдерживают 5-15 мин при рН 6-9 и 0-20 С, быстро отделяют образовавшийся осадок и определяют его радиоактивность. Предлагаемые диапазоны условий тестирования установлены экспериментальным путем и отражают основные свойства цитокининсвяэываащих компонентов используемой фракции растворимых белков злаков, Выход за указанные границы рН и температуры приводит к быстрому исчезновению цитокининсвязывающей активности тест-объекта и тем самым к инактивации тест-системы в целом, Отход от рекомендуемых параметров количественных соотношений белка и меченого гормона приводит к существенному уменьшению диапазона количественного определения цитокининовой активности и/или может вызвать значительный перерасход компонентов тест-системы,П р и м е р 1. В опыте используетсяфракция растворимых белков листьев ячме 5 ня, очищенная дробным высаливаниемсульфатом аммония, в количестве 0,5 мг белка на тест. Температуру системы поддерживают вблизи 20 С, рН 7,5, В качестверадиоактивного лиганда используют мече 10 ный тритием зеатин с удельной радиоактивностью 95 ГБк/ммоль и в количестве 35000расп/мин на тест, Испытуемым веществомслужит природный цитокинин зеатин, растворенный в 20 этаноле в воде, В конт 15 рольные пробы добавляют равный объемчистого, растворителя. При добавлении втест-систему зеатина в количестве 1,6 мкг иосаждении белков после 10 мин инкубациинаблюдается более чем двукратное умень 20 шение радиоактивности белкового осадкапо сравнению с контролем.Результаты этого (пример 1) и другихопытов представлены в виде сводной таблицы, где показано сравнение результатов определения для цитокининов (примеры 2 - 6)и иных соединений (примеры 7 - 10). На чертеже показана калибровочная кривая определения одного из представителейцитокининов дигидрозеатина, График де 30 монстрирует возможность количественногоопределения цитокининовой активности вшироком диапазоне концентраций этих биорегуляторов.Вся процедура от момента подготовки35 тест-объекта до получения готового результата может быть выполнена в течение 1 ч,Эта методика дает возможность проводитьсерийный анализ веществ -до сотни и болееэа смену - в строго идентичных условиях.40 Чувствительность способа была установлена в опытах с использованием очищенной фракции растворимых белков излистьев ячменя и меченого тритием дигидрозеатина с удельной радиоактивностью45 около 900 ГБк/ммоль в качестве меченоголиганда. Результаты показали, что минимальная концентрация немеченого дигидрозеатина, которая может бытьколичественно определена, составляет при 50 мерно 0,3 пикомоля, что для данной тестсистемы соответствует всего 66 пикограммэтого фитогормона. Тем самым предложенный способ позволяет повысить чувствительность определения цитокининов по55 сравнению с традиционными биотестами неменее чем на 3-4 порядка при существенной увеличении надежности определения.Предлагаемый способ не представляетопасности для здоровья персонала и дляокружающей среды, так как рассчитан на1808128 Продолжение таблицы Меченый лиган Опыт Немеченый лиган Р/активностьосадка, % к контролю тип/название название кол-во расп/минЦитокинины: зеатин дигидроэеатин кинетин бензиламинопурин дифенилкарбамид диги озеатин44 49 41 3 еатинЗеатинДигидрозеатинДигидроэеатин 35000 10000 100000 60000 1,6 0,8 1,0 0,5 Дигидроэеатин игид озеатин 80000 0,2 О,ООЭ77 82 65000 использование индикаторных микродоз одного из самых мягких изотопов - трития, находящегося на всех этапах тестирования в виде нелетучего соединения в разбавленном водном растворе. В связи с подбором условий хранения, при котором растворимые белки злаков не теряют своих полезных свойств, возможен централизованный выпуск препарата этих белков для обнаружения веществ с цитокининовой активностью.Таким образом, замена физиологических тест-систем на биохимическую выгодно отличает предложенный способ от прототипа тем, что в связи с высокой чувствительностью позволяет анализировать микроколичества веществ; значительно повышает скорость определения до 100 и более раз; позволяет проводить испытание сразу большого количества веществ до сотни и более за смену в строго идентичных условиях; исключает метаболизацию исследуемого вещества и тем самым позволяет определить его собственную цитокининовую активность; повышает объективность испытаний в связи с однородностью тест-объекта; дает возможность проводить испытания круглогодично независимо от сезона года; позволяет провЬдить испытания непосредственно на химических предприятиях без привлечения специалистов-биологов; дает возможность более точно классифицировать соединения по их 5 цитокининовой активности в данной системе и унифицировать процедуру испытаний. Формула изобретения 10 Способ обнаружения веществ с цитокининовой активностью, заключающийся в том, что на тест-объект воздействуют испытуемым веществом, а затем определяют цитокининзависимый параметр по сравнению 15 сконтролем, отличающийся тем,что,с целью повышения чувствительности и достоверности способа, в качестве тест-объекта используют фракцию очищенных водорастворимых белков, выделенных иэ 20 растений злаков, а количество 0,02 - 0,5мг/тест, в смеси с мечеными цитокининами с радиоактивностью 10000 - 100000 расп/мин на тест, воздействие осуществляют не менее 5 мин при температуре 0-20 С 25 и рН 6 - 9, в качестве цитокининзависимогопараметра определяют радиоактивность выделенных меченых цитокининов, ассоциированных с вышеуказанными белками,1808128 Продолжение таблицы Степень очистки обозначена цифрами: 1 - фракционирование сульфатомаммония; 2 - то же, что 1 плюс гель-хроматография; 3 - то же, что 2 плюсионообменная хроматография,ИУК - индолилуксусная кислота Не;дечеж длгддоэеСоставитель Г,Ром актор Л,Волкова Тех ред М.Моргента оК Н.ОЛ Корректор О,Кравцова тельский комбинат "Па город, ул,Гагарина, 101 оизв твенно-из Заказ 1400 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГК 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5