Способ определения активности мышиного токсина чумного микроба

(а сслоэ сс 1 п т;хих сслеиалисИче .ки РЕСПУГЛИК 775472 А ц 5 С 12 О 1/О ЕТЕНИ енный умный у государс ий против никова, А.С В.И.Марчен п 1 егп, - Е 12, М З,р.491 ЕНИЯ АКТ СИНА ЧУМ ковпсус 1. -499, ИВНО- НОГО робиолости ейд недостатзуетсл биоОсудАРстОенный кОмите гО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕСТИ МЫШИНОГО ТОМИКРОБА Изобретение относится к микгии, в частности к изучению активно д ствил бактериальных токсинов,При излучении бактериальных токсинов в качестве индикаторных систем часто используются культуры клеток, как высокочувствительные, стандартные и воспроизводимые модели.Известно использование для изучения действия холерного токсина и термолабильного энтеротоксина Е. со клеточной культуры СНО (Ооеггас Я.1., ВгаптопЛ3. 1 М. Оз 1977, ч. 135, р. 720 - 728), Чего (Оеппап У., Оаззу В, Апп. МссгоЬо 1 (1 пзт. Разтеог) 1984, ч. 135 В, р. 291-295) и других линий, основанное на специфическом изменении морфологии клеток (удлинение или округление) под действием токсина,Однако попытки использовать клеточные системы для определенил действия мышиного токсина чумного микроба оказались безрезультатными (Мопсе Т,С. 3. 1 птегп.(57) Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано длл изучения активности чумного токсина. Сущность изобретения: клеточную культуру, индикаторную к холерному токсину, обрабатывают "мышиным" (чумным) токсином в дозе 0,1 - 5 ЛД, инкубируют 5 - 60 мин. при 18 - 38 С, затем добавляют холерный токсин в дозе, индуцирующей морфологические изменения в культуре, а результаты оценивают по степени торможения морфологических изменений в опытной и контрольной пробах,Епсус 1. РЬаггласо 1, Телег., 1981, ч, 12, йЗ, р.491 - 499. Сальникова О.И., Рожков К, К., Алутин И,М, и др. В кн,: Бактериальные токсины, Тез, докл. 2 Всесоюзн. конф. Юрмала, 1989. - С. 115).Известен способ для определения активности "мышиного" токсина чумного микроба на животных (Мопт 1 е Т.С., А) 51. Катоге апс зуптпез 1 з о 1 гпог 1 пе охпз о 1 РазтеогеПа резт 1 з. М 1 сгоЬ 1 а 1 сохпз. К,У.,опс 1 оп, 1970, ч. 11. Вастег 1 а рготеи сохпз. СЬ. 1 - а).Самкам белых мышей весом 16 - 18 г внутрибрюшинно (или внутривенно) вводят ряд разведений препарата. Препарат одного разведения вводят 6 животным. Число павших мышей на разведение регистоируют через 24 ч,05 о выражают в микрограммах белка, определенного по методу Лоури, необходимого, чтобы убить 500 ь мышей и рассчитывают по разведенилм.Однако зтот способ имеет рлков, свлзанных с тем, что испольлогическая система (лабораторные животные), которую трудно стандартизировать по возрасту, полу, биологической активности. Последняя подвержена сезонным колебаниям и зависит от условий содержания животных (особенно температурного режима и питания). Кроме того, исследуются малые выборки животных из популяции. Все это ведет к низкой воспроизводимости результатов. Недостатком способа является его трудоемкость, связанная с содержанием лабораторных животных.Целью изобретения является повышение достоверности за счет стандартизации способа и увеличения объема выборки исследуемого биологического объекта,Настоящая цель достигается тем, что в качестве биологической модели используют культуру клеток, изменяющих морфологию под действием холерного токсина, а оценку активности ведут по тормозящему действию мышиного токсина на изменение морфологии клеток.Способ осуществляется следующим образом. Клеточную культуру, выращенную в ростовой среде с 1070 сыворотки плода коровы, переносят в культуральные панели с ростовой средой, содержащей 1% сыворотки и инкубируют при температуре 18 - 38 С в течение 5 - 60 мин. с препаратом мышиного токсина возбудителя чумы в дозе 0,1-0,5 Обо, определенной титрованием на белых мышах, затем в эту смесь добавляют холерный токсин в дозе, вызывающей достоверные изменения морфологии клеток (удлинение для СНО, округление для Чего). Активность действия мышиного токсина оценивают по степени торможения им морфологических изменений клеток под действием холерного токсина в опытной и контрольной (с кипяченым препаратом мышиного токсина) пробах,П р и м е р 1. Суспензию клеток (6 10 кл/мл среды Игла, содержащей 10 сыворотки коровы) СНО (СНО - К 1, институт Цитологии АН СССР, г. Ленинград) в объеме 50 мкл вносили в лунки 96-луночной культу- ральной плоскодонной панели (ОпЬго). Добавляли 50 мкл раствора мышиного токсина содержащего 0,1ОБо по дайным внутрибрюшинного титрования на белых мышах и инкубировали 5 мин при 38 С. Затем вносили 50 мкл раствора холерного токсина в Дозе, вызывающей изменения (удлинение в 2-3 раза) 157 ь клеток популяции СНО.В качестве контроля клеток испольэователи 50 мкл суспензии клеток СНО (610 кл/мл), к которой добавляли 50 мкл растворитблей холерного и мышиного токсинов, вданном случае -5 мМ раствор трис-НО буфера, рН 7,2.В качестве контроля действия холерного токсина брали 100 мкл суспензии клеток 5 СНО(3 10" кл/мл), добавляли дозу холерноготоксина, используемого в опыте в объеме 50 мкл,В качестве контроля действия мышиного токсина в 100 мкл суспензии клеток СНО 10 (3,10" кл/мл) добавляли дозу мышиного токсина, используемого в опыте в объеме 50 мкл.Для контроля специфичности действиямышиного токсина использовали кипяче 15 ный в течение 5 мин препарат мышиноготоксина.Контроль взаимодействия токсиновдруг с другом осуществляли в следующихвариантах: 20 253040 45 50 55"а" - токсины предварительно смешивали, добавляли эту смесь в культуру клеток и инкубировали;"б" - токсины смешивали, инкубировали и обрабатывали этой смесью клеток;"в" - культуру клеток инкубировали с холерным токсином, а затем добавляли мышиный токсин,Дозу и объемы токсинов, а также время и температура инкубации соответствовалитаковым в опытной пробе примера.Панель помещали в 5 0 СОг при 37 С на ночь. Затем считали с помощью инвертированного микроскопа количество клеток, изменивших морфологию в опыте и контролях. Для этого подсчитывали по 400 клеток в трех полях зрения в каждой лунке с 2 - 4 параллельными,В результате учета оказалось, что в предлагаемом нами способе изменили морфологию 10,0 2,0 (, в контроле клеток - 9,0 + 1,9 О/О, в контроле действия холерного токсина - 15,0 + 2,4 0, в контроле действия мышиного токсина -9,9 й 1,8 , в контроле специфичности - 15,7,5 , в контролях взаимного слияния токсинов друг на друга вариант "а" - 14,7 + 2,4 , вариант "б" - 14,0 .ф.1,8 , вариант "в" - 15,4 ф 2,5 6.Таким образом, мышиный токсин в дозе 0,1 05 одостоверно защищал клетки СНО от действия холерного токсина, вызывающего удлинение 15клеток, реакция носит специфический характер; использованная в опыте последовательность обработки клеточной культуры токсинами обоснована; мышиный токсин не оказывает прямого ингибирующего (или активирующего) действия на холерный токсин.П р и м е р 2, Условия опыта и система контролей, как описано в примере 1, но510 клетки СНО инкубировали с препаратом мышиного токсина в дозе 2 1.05 о 30 мин при 37 С, Холерный токсин использовали в дозе, вызывающей изменение морфологии половины клеток в популяции, В результате подсчета оказалось, что в опытной пробе изменили морфологию 11,02,0 % клеток, в контроле клеток - 8,5 + 1,7 %, в контроле действия холерного токсина - 50,0 2,4 %, в контроле действия мышиного токсина - 9,0 .1,8 %, в контроле специфичности реакции - 52,2 .ф.2,0 %, в контролях взаимного влияния токсинов друг на друга; "а" - 53,0 .ф. 2,4 %, вариант "б" - 50,0 +1,8 %, вариант "в" - 51,0+ 1,8 %.Таким образом, мышиный токсин в дозе 2 050 достоверно защищает клетки СНО от действия холерного токсина, вызывающего изменение 50 % клеточной популяции; реакция является специфичной, используемая , в.опыте последовательность обработки клеточной культуры - обоснованной: мышиный токсин не оказывает прямого ингибирующего действия на холерный токсин.П р и м е р 3. Условия постановки опыта и системы контролей как в примере 1, но клетки СНО инкубировали с препаратом мышиного токсина в дозе 5 Ю 5 о 60 мин при 18 С, а затем вносили препарат холерного токсина в минимальной дозе, вызывающей максимальный эффект (удлинение примерно 70 % клеток в популяции).При учете результатов выяснилось, что в опытной пробе изменили морфологию 35,5 М,2 % клеток в популяции, в контроле клеток - 10,0 +2,0 %, в контроле действия . препарата холерного токсина - 70,0 ч,5 %, в контроле действия мышиного токсина - 9,0 ф,0 %, в контроле специфичности - 69,1 .ф. 5,4 %, в контролях взаимного влияния токсинов друг на друга: "а" - 68,2 2,0 %; в варианте "б" - 71,3 +3,5 %, в варианте "в" -71,0 М,2 %.Таким образом, препарат "мышиного" токсина в дозе 5 Ю 5 о достоверно понижал реакцию клеток на холерный токсин в дозе, вызывающей изменение 70 % клеток популяции; реакция носит специфический характер; последовательность обработки клеточной культуры обоснована; мышиный токсин не оказывает прямого ингибирующего (или активирующего) действия на холерный токсин.П р и м е р 4, Для опыта использовали культуру клеток Чего (институт Цитологии АН СССР, г. Ленинград). Учет клеточной реакции оценивали в 4 - х бальной системе по степени изменения клеточного моносЛоя. Суточный монослой культуры Чего при по 20 25 30 35 40 45 50 55 севнойдозе 15 10 кл/мл, в объеме 100 мкл4среды Игла, содержащей 1 % сыворотки плода коровы, инкубировали с 25 мкл препарата мышиного токсина в дозе 2 Ю 50 при 37 С в течение 30 мин. Затем добавляли 25 мкл холерного токсина в дозе, вызывающей изменения морфологии (округление) примерно половины клеток популяции (реакция на 2 балла). Условия культивирования, как система контролей аналогичны описанным в примере 1.При учете результатов оказалось, что в опытной пробе. изменений клеточной морфологии не наблюдалось, в контроле клеток- тоже, в контроле действия холерного токсина отмечены изменения на 2 балла, в контроле действия мышиного токсина изменений монослоя не было, в контроле специфичности отмечены изменения на 2 бэлла, в контролях взаимного влияния токсинов друг на друга: вариант "а" - изменения на 2 балла, вариант "б" - изменения на 2 балла, вариант "в" - изменения на 2 балла,Таким образом, мышиный токсин в дозе 2ОБ 0 полностью защищает клетки Чего от действия холерного токсина, вызывающего изменения морфологии клеток Чего на 2 балла, реакция специфична, прямого ингибирующего (или эктивирующего) действия холерного токсина мышиным не отмечено,П р и м е р 5. Объемы проб, доза клеток и способ испытания препаратов в культуре клеток СНО аналогичны описанным в примере 1, Для количественного препарата мышиного токсина сначала находят цитотоническую единицу холерного токсина (ЦТЕ 5 о ХТ). Для этого двухкратные разведения препарата холерного токсина (ХТ) (8 мкг/мл) испытывают в системе клеток СНО, Рассчитывают дозу холерного токсина, вызывающую.50 % изменение морфологии клеток и ее доверительные интервалы (Боярский А.Я 1955, с. 243-249, при и = 1200 подсчитанных клеток на каждую дозу и р = 0,05, с применением системы пробитов (Ашмарин И.ПВоробьев А.А., 1962, с. 93 - 104, 173). Как видно из рис. 1, она составляет 5,15 (6,3 - 4,4) нг/мл при разведении ХТ 1;1550 (1: 1780 - 1: 1260), которое вызывает 50;0 + 3,2 % удлинения клеток популяции.Затем двухкрэтные разведения препарата (2,5 - 0,00195 мкг/лунка) мышиного токсина (Ш 5 о = 2 мкг) вносят в лунки с клетками СНО. После 30 мин инкубации при 370 С в лунки добавлгпот холерный токсин в дозе, равной 2 ЦТЕ 50 ХТ (1: 890 - 1: 630), что соответствует 10,3 (12,7-9,0) нг/мл, вызывающей 62,0 + 3,1 % удлинения клеток популяции. После ночной инкубации панель1775472 Составитель К.РожковТехред М,Моргентал Корректор Л,Лукач Редактор А,Бер Заказ 4022 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 микроскопируют и определяют статистически достоверную дозу мышиного токсина, снижающую процент удлиненных клеток до 50 ф уровня. Эту дозу считают эквивалентной 1 ЦТЕ 5 о ХТ, она составляет 0,18 (0,16- 0,21) мкг.Таким образом, на предложенной модели клеточной культуры СНО получена количественная характеристика антицитотонического антихолерогенного) действия мышиного токсина,Формула изобретения Способ определения активности мышиного токсина чумного микроба путем введения исследуемого токсина в биологическую модель и оценки результатов, о т л и ч а ю щи й с я тем, что, с целью повышения достоверности за счет стандартизации способа, в 5 качестве биологической модели используюткультуру клеток, чувствительных к действию холерного токсина, после введения мышиного токсина культуру инкубируют в течение 5-60 мин при 18 - 38 С, далее добавляют 10 холерный токсин в дозе, вызывающей морфологические изменения у 15-73,5; клеток культуры, и определяют активность мышиного токсина по количеству морфологически измененных клеток,15