Способ определения генотоксичности водорастворимых веществ

. бел 3ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРк.Авторскому свидетельству 1(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт по охране вод и Харьковский государственный университет им, А.М,Горького (72) Е,В.Усенко, А,И,Божков и П.А.Калиман (56) Ечацй 1 оп оЮ а депотох 1 сЮ тезт веазцг 1 пд ОНА-зтгапб Ьгеа 1 сз 1 п п 1 оцзе 1 цщрЬоеа сеНз Ьу айайпе цпв 1 псИпд апс 1 пубгохуарагат 1 те ецбоп / ОагЬегд Рег, А 1 сегЫое Еча-епа, Воез 1 о 1 Ф 6 еогде. // Мцтат. Вез, Епч 1 гоп. Мцтатдепез апб йе 1 ат. ЗцЬ), 1988, 203, М 3, р. 155-176.Авторское свидетельство СССР йв 1507275, кл. А,01 К 61/00, 6 01 й 33/18, 1989.Авторское свидетельство СССР И. 1,257518, кл,6 01 М 33/48, 1986. Изобретение относится к микробиологии, водной токсикологии и предназначено к использованию для биологического контроля за токсичными водорастворимыми веществами, а также может быть использо. вано для контроля сточных и природных вод и при оценке генотоксичности водорастворимых веществ при исследовании генетических основ адаптации организмов к изменяющимся условия окружающей среды.Известен способ оценки теста на гено- токсичность, использующий определение разрывов нитей ДНК в клетках лимфрмы мыши при щелочной денатурации с элюцией через оксиапатит. 1755194 А(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТОКСИЧНОСТИ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ВЕЩЕСТВ(57) Использование;микробиологии, водная токсикология, биологический контроль за токсичными водорастворимыми веществами, контроль сточных и природных вод, оценка генотоксичности. Сущность изобретения; определение генотоксич ности проводят, внесением исследуемых веществ в культуральную среду инфузорий ТетгаЬутепа ругИога 1 з и экспозицией с меченным предшественником, После чего определяют удельную" радиоактивность тотальных ДНК и РНК в клетках инфузорий. по изменению удельйой радиоактивности нуклеиновых кислот судят о генотоксичности исследуемых веществ, Дополнительно могут быть использованы водоросли СЫогеПа нц 1 даг 1 з. 2 табл. Этот известный способ затруднительно использовать для контроля сточных и природных вод вследствие необходимости введения их во внутрь оргайизма и, кроме того, не каждый последующий токсикант приводит к разрывам ДНК,Известен способ биологической оценки токсичности водй, согласно которому производят экспозицию рачков-дафний в исследуемой воде и по числу погибших дафний и длительности экспозиции судят о степени токсичности исследуемой воды. достатком этого способа являетс высокая чувствительность, т.к, по ги дафний возможно оценивать тольк25 30 35 УТф на 150 мл культуральной жидкости и 45 50 55 высокие дозы токсиканта, что ограничивает область использования.Известен также способ определения токсичности водорастворимых веществ, согласно которому инфузории ТетгаЬувепа ругНогвз диспергируют в культуральной среде, регистрируют динамику изменения величин светопропускания культуры до и после экспозиции с исследуемым веществом и по изменению двигательной активности при еоэдеиствии исследуемого вещества раэличйой концентрации оценивают его токсичность.Недостатком этого способа является низкая чувствительность и недостаточность интерпретации полу енных результатов, т,к. двигательная активность инфузорий является интегральным показателем. Этим способом не обеспечивается оценка гено- токсичности, что ограничивает область использования,Цель изобретения - повышение чувствительности и достоверности определения и расширения области использования. Способ осуществляется следующим образом.В суточную культуру инфузорий Те 1 гайувепа руг 1 огвз, растущую на пептонной среде (пептон 20 г, дрожжевой экстракт 1 мл, глюкоза 5 г. НаС - 1 г, вода дистиллированная до 1 л, рН 7,1) при 27 С и содержащую 60 - 80 тыс, особей в 1 мл, или 5-суточную культуру СЫоге 11 а чц 1 даг 1 з, культивируемую на солевой среде Успенского(КМОз 0,025 г, МдЯОд 0,025 г, Са(КОз)2 0,1 г,КН 2 РО0,025, К 2 СОз 0,0345, вода дистиллированная до 1 л, рН после стерилизации 7,0 - 7,3) в люминостате с освещбенностью 2000 люкси содержащую 5 10 клеток в 1 мл, вносят растворы испытуемых веществ в различных дозах (0,001; 0,01 и 1,0 мг/л), Спустя 30 - 40 мин после внесения испытуемых веществ в культуру инфузорий вносят по 2,97 МБк Н -тимидина и 2,97 МБк Н производят инкубацию в течение 30 мин при 27 - 28 С. После окончания инкубации каждуюпробу разделяют на 3 равные части, соответственно по 50 мл каждую, охлаждают и вносят хлорную кислоту до 5% конечной концентрации. Образцы охлаждают в течение 30 мин и сформировавшийся осадок собирают центрифугированием при 1000 д в течение 10 минут, Полученные осадки трижды промывают 50 хлорной кислотой, после чего из осадков извлекают тотальную РНК. Для этого к ним прибавляют 0,3 н гидрат окиси калия, суспендируют и производят инкубацию образцов при 37 С в течение 1,5 ч. После окончания инкубации 5 10 15 20 пробы охлаждают и вносят хлорную кислотудо 5 концентрации, через 15 мин их центрифугируют при 1000 дв течение 10 минут,затем собирают надосадочную жидкость,которая представляет нуклеотиды РНК,Полученные осадки промывают 2 мл 5НС 104, после чего осадки объединяют с первой надосадочной жидкостью и в общемобъеме определяют содержание РНК по известному методу Спирина.По 0,5 мл из каждого образца вносятво флаконы с диоксановым сцинтиллятороми определяют радиоактивность на сцинтилляционном счетчике, результаты выражаютв импульсах в минуту на 1 мг РНК (удельнаярадиоактивность РНК).Осадок, полученный после выделенияРНК, гидролизуют в 5НС 104 на водянойбане при 90-95 С в течение 20 мин собратным холодильником. Надосадочнуюжидкость переносят в чистые пробирки иопределяют содержание ДНК и удельнуюрадиоактиеность,Полученные значения для трех параллельных проб усредняют и сравниваютудельные радиоактивности контрольных иопытных образцов. Уменьшение величинудельной радиоактивности свидетельствуетоб угнетении скорости синтеза нуклеиновыхкислот, а в случае увеличения удельной радиоактивности - об увеличении скоростисинтеза РНК или ДНК.Достоверное увеличение или уменьшение удельной радиоактивности нуклеиновых кислот по сравнению с контролемуказывает на проявление генотоксичностиисследуемых веществ,П р и м е р 1, В 3-х суточную культуруТетгаЬувепа,ругИогв 1 з, растущую нв пептонной среде при 27 С, вносили по 2,97МБк Н -тимидина и 2,97 МБк Н -УТФ и выз здерживали в термостате при 28 С. Спустя20, 40, 60, 80 и 100 мин извлекали пробы,охлаждали и в каждую из проб вносилихлорную кислоту до конечной концентрации50 ь. Из полученных осадков щелочным иликислотным гидролизами извлекали РНК иДНК и определяли их удельную радиоактивность,В 5-ти суточную культуру водорослейСЫогеПа чцдагз вносили по 2,97 МБк Нтимидина и 2,97 МБк Н -УТФ и спустя 10, 20,30 и 40 мин извлекали пробы, охлаждалии вносили в каждую из них хлорную кислотудо конечной концентрации 5;, Осадки собирали центрифугированием, из них извлекали РНК и ДНК и определяли их удельнуюрадиоактивность,В табл. 1 приведены результаты определения удельной радиоактивности ДНК иРНК в клетках водорослей и в клетках инфузорий при различности времени экспозиции и эти приведенные данные показывают,что при экспозиции до 30 минут удельнаярадиоактивность ДН К и РНК в клетках водорослей увеличивается, а при дальнейшемувеличении времени экспозиции эта величина остается неизменной, а в клетках инфузорий эта величина увеличивается приэкспозиции до 60 мин, 10Данные опытов показывают, что дозаизотопов 2,97 МБк является достаточной,чтобы получить высокую удельную радиоактивность нуклеиновых кислот в клетках водорослей и инфузорий соответственно. Как 15видно изполученных результатов, оптимальным времени экспозиции является 3060 мин,П р и м е р 2. В 3-х суточную культуруинфузорий ТетгаЬущепа ругИогт 1 з, растущую на пептонной среде при 27 С, вносили 0,5 мг/л меди и спустя 10, 20, 30 и 40минут извлекали пробы культуры. В каждуюиз проб вносили 2,97 МБк Н -тимидина и2,97 МБк Н -УТФ, Затем производили инку3бацию каждых образцов в течение 60 минутпри 28 С, после чего охлаждали и вносилихолодный раствор хлористой кислоты до 5 Оконечной концентрации. Через 30 мин осадок собирали центрифугированием при 3010009 в течение 10 мин, после чего для каждого образца определяли удельную радио. активность ДНК и РНК в клетках инфузорийс разной продолжительностью экспозиции.Результаты опытов приведены в табл, 2. 35Данные опытов показывают, что привнесении 0,5 мг/л меди в среду с инфузориями и экспозиции их до 20 - 30 мин до инесения в культуральную среду меченныхпредшественников нуклеиновых кислот, наблюдается достоверное снижение удельнойрадиоактивности нуклеиновых кислот, Это снижение коррелируют с угнетением роста культуры через 24 и 48 ч после внесения токсиканта,При сравнении влияния 0,5 мг/л меди 45на удельную радиоактивность нуклеиновыхкислот и отдельно на подвижность инфузорий, определяемую способом по прототипу,обнаружено; что если подвижность изменяется на 26%, то удельная радиоактивность ДНК изменяется через несколькоминут после внесения токсиканта на 50 О/.Таким образом, изменение удельной радиоактивности нуклеиновых кислот в клеткахинфузорий или водорослей фиксируют внесением радиоактивных предшественниковв культуральную среду через 20-30 мин после внесения токсиканта, что в несколькораз быстрее по сравнению с учетом численности клеток. Предлагаемый способ обеспечивает большую чувствительность по сравнению с оценкой токсичности, проводимой по изменению подвижности тест-объектов, кроме того, он позволяет оценить не только общую токсичность, но и генотоксичность, т,е. токсичность, затрагивающую генетическую систему клеток,П р и м е р 3. Культуру водорослей СЫоге 1 а чи 19 аг 1 з, растущую на среде Успенского в люминостате сосвещенностью 2000 люкс при температуре 20 С, разделяли на отдельные пробы, в каждую иэ которых вносили соответственно 0,005; 0,01; 0,1 или 0,5 мг/л ртути, Спустя 30 мин после внесения токсиканта в каждую иэ проб вносили по 2,97 МБк Н -тимидина и через 30 мин культуру охлаждали и клетки осаждали хлорной кислотой, после чего определяли удельную радиоактивность ДНК.Результаты опытов, представленные на фиг. 1 и 2, показывают, что ионы ртути в концентрации 0,005 и 0,01 мг/л не оказали влияния на скорость синтеза ДНК, а доза в 0,1 мг/л подавляла скорость ДНК на 96, Увеличение дозы токсиканта в 5 раз полностью подавляло включение радиоактивной метки в ДНК (на 99%), Влияние этих доэ ртути на численность клеток водорослей через 3, 6, 9 и 12 суток после начала эксперимента не оказывалось, что указывает на существование механизма адаптации.Генотоксичность, определяемая через 30-60 мин после внесения токсиканта по скорости синтеза ДНК. позволяет оценить прямое влияние испытуемых веществ на функцию генетического аппарата без наложения адаптивных способностей тест-обьектов.Таким образом, предлагаемый способ позволяет определять концентрации веществ, оказывающих влияние на генетический аппарат водорослей,П р и м е р 4. Культуру водорослей СЫогеИа чо 19 аг 1 з, растущую на среде Успенского в люминостате с освещенностью 2000 люкс при температуре 20 С, разделяли на отдельные пробы, в каждую из которых вносили соответственно 0,05; 0,1; 0,25; 0,5 и 1,0 мг/л кадмия. Спустя 30 минут после внесения токсиканта в каждую из проб вносили по 2,97 Мбк Н -тимидина и через 30 минзкультуру охлаждали и клетки осаждали хлорной кислотой, после чего определяли удельную радиоактивность ДНК.Таким образом, предлагаемый способ оценки генотоксичности позволяет в короткое время дать ответ о влиянии испытуемых веществ на функцию генетического аппарата тест-объектов,1755194 Таблица 1Продолжение табл.3 блиц П р и м е р 5, 3-суточную культуру инфузорий ТесгаЬупчепа руг 11 ога 1 з, растущую напептонной среде, разделяли на отдельныепробы, в каждую из которых вносили соответственно 0,1; 0,5 и 1,0 мг/л ионов меди. 5Спустя 30 мин после внесения токсиканта вносили по 2,97 МБк Н -тимидина и НУТФ. После 60 минут инкубации культуруохлаждали и клетки осаждали хлорной кислатой, после чего определяли удельную радиоактивность ДНК и РНК,Медь в концентрации 0,1 мг/л снижаетудельную радиоактивность ДНК в клеткахинфузорий на 340 , а увеличение концентрации до 0,5 и 1,0 мг/л уменьшает этот 15показатель на 65 и 5 Я% соответственно,Удельная радиоактивность тотальной РНКпри внесении 0,1 мг/л меди понизилась на50 по сравнению с контролем. Увеличениеконцентрации меди в среде в 5 и 10 раз не 20приводило к дальнейшему изменениюудельной радиоактивности РНК клеток инфузорий. Инкубация клеток с ионами медив концентрации 0,1 мг/л снижало численность инфузорий на 600 через 24 ч после ее 25внесения в культуральную среду, Дальнейшее увеличение концентрации меди в средене влияло на интенсивность размноженияинфузорий. Таким образом, медь обладает генотоксичностью, и предлагаемый способ оценки генотоксичности позволяет в короткое время дать ответ о влиянии испытуемых веществ на функцию генетического аппарата инфузорийФормула изобретения Способ определения генотоксичности водорастворимых веществ, включающий внесение исследуемых веществ в культуральную среду инфузорий ТетгаЬутепа ругЮога 1 з и экспозицию их с исследуемым веществом, отличающийся тем,что,с целью повышения чувствительности и достоверности определения и расширения области использования, после внесения исследуемого вещества в культуральную среду дополнительно через 20-30 мин производят инкубацию инфузорий в течение 30-60 мин с меченным предшественником, после чего определяют удельную радиоактивность тотальных ДНК и РНК в клетках инфузорий, а о генотоксичности исследуемых веществ судят йо оценке их влияния на удельную радиоактивность нуклеиновых кислот инфузорий,2. Способ поп,1,отличающийся тем, что культуральная среда дополнительно содержит водоросли СЫогеПа чо 1 даг 1 з