Способ супрессии иммунного ответа

.Сиплив рьева П.П., Голубий папаина на имивность больных- Применев растений н) в широкой 8, с. 67-71. ника,возимокопаи197 ется повыше- а за счет снисивн азатв ка мир ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗО КОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(53) 612.015(088.8) (56) Г,А,Космидиади, Григо цов Г.МВлияние инъекц мунологическую реакт остеохондрозом позвоноч ние протеолитических э Сагса Гараца (лекозим, ле медицинской практике, М Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для подавления формирования гуморального иммунного ответа (ГИО) и гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) в экспериментальных исследованиях на животных,Известно применение имммунодепресых средств, например циклофосфана, иоприна, 5-фторурацила, метотрексата честве препаратов, подавляющих форование ГИО,Однако применение иммунодепрессивных средств вызывает нежелательные побочные эффекты, в том числе лейкопению, лимфопению, агранулоцитоз, нарушение функции печени,Известно влияние инъекции папаина на иммунологическую реактивность больных остеохондрозом позвоночника.Однако при введении протеолитических ферментов (папаина) могут наблюдаться отрицательные побочные эффекты; изменение свертываемости крови, аллергические реакции.(54) СПОСОБ СУПРЕССИИ ИММУННОГО ОТВЕТА(57) Использование; медицина, биология для подавления формирования гуморального иммунного ответа (ГИО) и гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) в экспериментальных исследованиях на животных. Суиность изобретения; трехкратно внутрибрюшинно вводят сингенные прогретые эритроциты, обработанные папаином в дозе 10 мкг, 2 табл. Целью изобретения являние физиологичности способжения побочных эффектов.Цель достигается тем, что животным перед иммунизацией трехкратно с интервалом 24 ч внутрибрюшинно в дозе 2 10 клеток на 100 г массы тела вводили сингенные эритроциты, предварительно прогретые в течение 15 мин при 42 С и обработанные папаином в дозе 10 мкг. Первую инъекцию при трехкратном введении сингенных эритроцитов проводили в день введения сенсибилизирующей дозы антигена,Для изучения развития ГИО антиген, например эритроциты барана (ЭБ), вводили в дозе(1,9-2,1) 10 клеток на 100 г массы тела. Через 5 дней после введения антигена животных умерщвляли под эфирным наркозом и в селезенке определяли количество клеток, образующих антитела к ЭБ (АОК), и клеток, образующих розетки с ЭБ (РОК).Для изучения ГЗТ сенсибилизирующую дозу эритроцитов (10 клеток в 0,3 мл0,15 М хлористого натрия) вводили внутрибрюшинно. Через 4 сут вводили разрешающую дозу эритроцитов (10 клеток в 0,1 мл 0,15 М хлористого натрия) в подушечку правой лапки задней конечности. В подушечку левой лапки вводили 0,1 мл 0,15 М хлористого натрия, Выраженность ГЗТ определяли через сутки после введения разрешающей дозы ЭБ по разнице веса и количества карриоцитов регионарного и контралатерального лимфатических узлов.Наибольшим иммуносупрессорным эффектом обладают сингенные эритроциты, прогретые 15 мин при 42 С, обработанные папаином (доза 10 мкг) и введенные трех- кратно, внутрибрюшинно, в разовой дозе 2 10 клеток на 100 г массы тела.П р и м е р 1, Эритроциты интактных крыс обрабатывали папаином по следую 8 щей схеме; к,15 мл осадок эритроцитов (25 10 клеток) добавляли 1 мл раствора фармацевтического препарата папаина, содержащего 10 или 50 мкгактивного вещества, и инкубировали в термостате при 37 С в течение 3 ч, встряхивая каждые 0,5 ч. Затем эритроциты трижды отмывали физиологическим раствором и центрифугировали при 2500 об/мин в течение 15 мин, Сингенные эритроциты, обработанные папаином, вводили однократно или трехкратно с интервалом 24 ч внутрибрюшинно вдозе 210 клеток на 100 гмассы8тела здоровым крысам, В последний день введения сингенных эритроцитов животных внутрибрюшинно иммунизировали ЭБ в дозе 2 10 клеток на 100 г массы тела. Через 5 дней курс умерщвляли и определяли в селезенке количество АОК и РОК, О степени подавления иммунного ответа судили по сравнению с соответствующими показателями контрольных групп животных, получивших однократные или трехкратные инъекции нативных эритроцитов,Для изучения ГЗТ сингенные эоитроциты, обработанные раствором папаина, содержащего 10 или 50 мкг активного вещества, вводили однократно или трех- кратно внутрибрюшинно с интервалом 24 ч в дозе 2 10 клеток на 100 г массы тела здоровым крысам. В первый день введения сингенных эритроцитов животным внутрибрюшинно вводили сенсибилизирующую дозу ЭБ (10 клеток в 0,3.мл 0,15 М хлористого натрия). Через 4 сут в подушечку правой лапки задней конечности вводили разрешающую дозу эритроцитов барана (10 клеток в 0,1 мл 0,15 М хлористого натрия). В подушечку левой лапки вводили 0,1 мл 0,15 М хлористого натрия. О выраженности ГЗТ судили через сутки после введения разрешающей дозы ЭБ по разнице веса ивнут 8 оибрюшинно с интервалом 24 ч, в дозе 2 10 клеток на 100 г массы тела здоровымкрысам.40 В первый день введения сингенныхэритроцитов животным внутрибрюшиннобвводили сенсибилизирующую дозу ЭБ (10 клеток в 0,15 мл хлористого натрия). Через 4 сут в подушечку правой лапки задней ко нечности вво 8 дили разрешающую дозу эритроцитов (10 клеток в 0,1 мл 0,15 М хлористого натрия), Напряженность ГЗТ определяли через сутки после введения разрешающей дозы эритроцитов по разнице веса 50 и количества карриоцитов регионарного иконтралатерал ьного лимфатических узлов, О степени подавления развития ГЗТ судили посравнению с соответствующими показателями групп животных, получивших инъек ции нативных эритроцитов.. Полученные данные свидетельствуют отом, что введение сингенных прогретых эритроцитов не влияет на развитие ГИО и ГЗТ по сравнению с контрольными группами (табл,1). 102035 количеству ядросодержащих клеток регионарного и контралатерального лимфатических узлов.Установлено, что как однократное, так и трехкратное введение нативных эритроцитов, обработанных папаином в дозах 10 или50 мкг, не приводит к достоверному изменению показателей ГИО и ГЗТ по сравнению с группами животных, получавших инъекции нативных необработанных эритроцитов (табл.1).П р и м е р 2. Эритроциты интактныхкрыс прогревали в термостате по следующей схеме: 0,15 мл осадка эритроцитоввзвешивали в 1 мл среды 199 и прогревали 15 мин при 42 С. После прогревания эритроциты трижды отмывали физиологическим раствором и центрифугировали при 2500 об/мин в течение 15 мин,Для изучения развития ГИО сингенные прогретые эритроциты вводили однократно или трехкратно с интервалом 24 ч внутрибрюшинно в дозе 2 10 клеток на 100 г массы8тела здоровым крысам. В последний деньвведения сингенных эритроцитов животных внутрибрюшинно иммунизировали ЭБ в дозе 2 10 клеток на 100 г массы тела. Через 5 дней крыс умерщвляли и определяли в селезенке количество АОК и РОК. О степени подавления иммунного ответа судили посравнению с соответствующими показателями контрольных групп, получавших однократно или трехкратно инъекции нативных эритроцитов. Для изучения влияния на развитие ГЗТ сингенные прогретые эритроциты вводили однократно или трехкратно1737341 П р и м е р 3, Эритроциты интактных крыс прогревали в термостате по схеме (см. пример 2), трижды отмывали физиологическим раствором, центрифугировали при 2500 об/мин в течение 15 мин, Затем про гретые эритроциты обрабатывали раствором папаина, содержащего 10 или 50 мкг активного вещества по схеме (см, пример 1).Выраженность ГИО оценивали по количеству АОК в селезенке по сравнению с со ответствующими показателями групп животных, получивших нативные эритроциты, сингенные эритроциты, обработанные папаином, или эритроциты, подвергнутые прогреванию, О напряженности ГЗТ судили 15 по разнице веса и количеству карриоцитов регионарного и контралатерального лимфатических узлов по сравнению с контрольными группами.П ри испол ьзован ии и редла гаемой мо дели следует избегать изменения доз папаина, т.к, низкая доза папаина 0,1 и 1 мкг не вызывает иммуносупрессорного эффекта; высокая доза папаина 100 и 150 мкг в отдельных случаях может вызвать стимуля цию иммунного ответа за счет пирогенного эффекта (1,2 - 1,5% случаев),Перегревание эритроцитов (45 15 мин или 42 25 мин) вызывает значительный гемолиз эритроцитов и, как следствие, отсут ствие иммуносупрессорного эффекта (табл.2). Эффективность прецлагаемой мог Док,тыс,ор га н Условия опыта 7,2+1,6 97 2,1 41,5+4,9 25, 7+2,4 27,1+3,2,4+1,8 9,5+1,9 440+."3 103+24 7,7+1,6 45,6+5,7 28,3+3,4 94+2,4 40,2+4,6 7,0+;,3 240+25 8,8 ч.1,8 23,6.2,4 39,7 ф 4,1 7 1+5 25,1+4,0 .9,6+ч,7 6,9+18 10, 1+1 9 41,8+5,9,1 Ф 1,2 26 243 1 73.20 10,4 ф 2,2 7,5+1 ч 42,84,3 27,8+3,3 9,4 ф 1,7 7,641, 6 43,44 45 2+ 18 5+2 1 32 5+3 9 4 "+0Контроль без введения нативных эритроцитов) Однократное введение нативныхэритроцитов Трехкратное введение нативныхзритроцитов Однократное введение эритроцитов, обработанных гапзинои в дозе 10 икг Трехкратное введение эритроцитов, обработанных пзпаинои вдозе 10 икг Однократное введение эритроцитов, обработанных папаиноив дозе 90 мкг Трехкратное введение эритроцитов обработанных папаинои вдозе 50 мкг Однократное введение прогретых эритроцитов Трехкратное введение прогретых эритрэцитов Однократное введение прогретых эритроцитов, обработанных папаином в дозе О икг дели супрессии иммунного ответа 98 - 98,5%.Таким образом установлено, что максимальный иммуносупрессорный эффект наблюдается при трехкратном введении сингенных прогретых эритроцитов, обработанных папаином в дозе 10 мкг (табл.1).Результаты исследования показали, что трехкратное введение прогретых сингенных эритроцитов, обработанных папаином, ингибирует не только развитие ГИО, но в значительно большей степени угнетает развитие ГЗТ, что может способствовать значительному подавлению аллергических процессов в организме. Способ угнетения формирования иммунного ответа не вызывает вредных побочных эффектов, прост в исполнении, не токсичен и стабилен в получении результатов,Формула изобретенияСпособ суп рессии иммунного ответа путем введения в организм животного иммунодепрессанта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения физиологичности способа за счет снижения побочных эффектов, в качестве иммунодепрессанта используют син генные эритроциты, предварительно обработанные папаином в дозе 10 мкг на 0,15 мл осадка эритроцитарной массы, причем эритроциты вводят внутрибрюшинно трех- кратно с суточным интервалом,Таблица 1 РОК,Разница массы, Разница количестмлноргачмгвд кариоцитов1737341 РОК, Разница массы, Разница количестмлн/орган мг ва кариоцитов Условия опыта Трехкратное введение прогретых эритроцитов, обработанныхпапаином в дозе 10 мкг 10 6 ь 1 4 18 4+2 2 1,7+О 5 2,6+0,9 Однократно= ввсдение прогретыхэритроцитов, обработанных папаином в дозе 50 мкг,35,3 ф 3,1 6,1 1,2 7,3+1,8 21, 2+1, 9" Трехкратное введснис эритроцитов, обработанных папаиномв дозе 50 мкг) 6,4+1,7 5294 31,4 Й 2,9 20,11,8 П р и м е ч а н и е, 1. Каждая средняя получен" на 10 крысах.2. Значками т иобозначена существенность отличий средних(123 случаев) 4,6+5,1 7, О+1,4 10,1+3.11 26,8+2,8 П р и м е ч а н и я. 8 каждой группе использовано 10 животных. Стимуляция иммунного ответа в 4 и 5 гр. отмечена у 1,5"1,2 Ф используемых животных. Составитель А,АгуреевТехред М.Моргентал Корректор Л.Бескид Редактор М,Циткина Заказ 1887 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 2 Трехкратнбе введсние прогретых при 42 С 15 мин эритроцитов, обработанных папаином в дозе 0,1 мкг 3 Трехкратное введение прогретых при 42 С 15 мип эритроцитов, обработанных папаином в дозе 1 мкг Трехкратное введение прогретых при 42 С 15 минэритроцитов, обработанныхпапаном в дозе 100 мкг 5 Трехкратное введение прогретых при 42 С 15 минэритроцитов, обработанных папаином в дозе150 мкг 6 . Трехкратнос введениеэритроцитов, прогретыхпри. 45 С 15 мин и обработанных папаином с дозе10 мкг Г А,К тыс,орган Разница массы,лимФоузлов,мг Разница количества карриоцитов в лимФоузлах, 1 10 б