Способ получения l-аспарагиназы

(5)5 С 12 й 1/20, С 12 й 9/82//(С 12 й 1/20,С 12 В 1:18) ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Х(21) 4703756/13 268 М 12 В, 268 МИ в аэробных глубинных (22) 12.06.89 условиях на среде, содержащей источник (46) 23,02.92. Бюл. И. 7 углерода, источник аминного азота, мине- (71) Институт органическогосинтезаАН".:. . ральные соли и воду, при этом посевной ЛатвССРЙ 1 Институт микробиологии им,материал и инокулят выращивают на среде,Августа Кирхенштейна Ан ЛатвССРсодержащей 0-галактозу в качестве источ(72) С, В; Лопатнев, Д, Н. Игнас, И, И, Жук, никауглерода,аосновнуюферментациюве- Р. К,Озолинь, П, П, Гривиня, Л, Ф.Савенко-дут на среде, содержащей глюкозу в ваи И.А. Винакачестве основного источника углерода, и (53) 577.15(088.8) глюкозу вводят в питательную среду после (56)Авторскоесвидетельство СССР1,5-2;0 ч после начала культивирования в М 649746, кл, С 12,й 9/82, 1976. проточном режиме с концентрацией и соАвторское свидетельство СССР скоростью, обеспечивающей потреблениеМ 406877, кл. С 12 1 ч 1/20, 1971,ее культурой и поддержание остаточной ее (54)СПОСОБПОЛУЧЕНИЯ 1:АСПАРАГИНА- концентрации, близкой к нулю, в течение ЗЫ всего процесса культивирования. Посевной(57) Изобретение относится к микробиоло- материал выращивают на среде, содержагии и касается способа получения фермент- щей галактозу,в количестве 0,9-1,1, а осного препарата 1-аспарагиназы, новную ферментацию ведут на среде, используемого в медицине в качестве анти- содержащей глюкозу в суммарном количелейкозного препарата. Целью изобретения стве 0,8-1,170, В результате получают биоявляется увеличение выхода и удельной ак- массу штаммов Егчч 1 п 1 а саготочога со тивностифермента. 1:аспарагиназу.получа- средней активностью фермента 20,4 МЕ/мг ют путем культивирования продуцентов - сухого вещества и выходом фермента в штаммов Егччп 1 а саготочога . - 268, 268 М, среднем до 83,6 МЕ/мл среды,ф аминного азота, минеральные соли и воду, при этом посевной материал и инокулят выращивают на среде, содержащей галактозу в качестве источника углерода, а основную ферментацию ведут на среде. содержащей глюкозу в качестве основного источника углерода, и глюкозу вводят в питательную средупосле 1,5-2,0 ч с начала культивирования в приточном режиме с концентрацией и со скоростью, обеспечивающей потребление ее культурой и поддержание остаточной ее концентрации, близкой к нулю, в течение. Изобретение относится к микробирлогии и касается способа получения ферментного препарата 1-аспарагиназы; используемого в медицине в качестве. антилейкозного препарата.Цель изобретения - увеличение выхода , и удельной активности фермента, .Изобретение заключается в том, что продуценты - штаммы Егчч 1 п 1 а саготочога268, 268 М, 268 М 12 В, 268 МЯ культивируют в аэробных глубинных условиях на среде, .; содержащей источник углерода, источник1713929 это обеспечивает сохранение высокогоуровня синтеза фермента. всего процесса культивирования. Посевной материал и инокулят выращивают на среде, содержащей галактозу в количестве 0,9- 1,1 О, Основную ферментацию ведут на среде, содержащей глюкозу в суммарном количестве 0,9 - 1,1%.Использование глюкозы в приточном режиме с концентрацией и со скоростью, обеспечивающей потребление ее культурой и поддержание ее остаточной концентрации, близкой к нулю, позволяет избежать репрессирующее действие глюкозы на синтез-аспарагиназы и обеспечить высокое суммарное количество используемой глюкозы 0,9-1,1;) среды. Последующее введение глюкозы в основную ферментацию после 1,5 - 2,0 ч роста позволяет полностью ,использовать остаточную галактозу иноку,лята, Одновременно происходит синхронизация культуры.Способ осуществляют следующим образом,В качестве продуцента используют культуру Евчиа саготочога 268 или фагоустойчивую к.;яьтуру - Евчиа саготочога 268 М или фаго- и стрептомицинустойчивую культуру Епмпа саготочога 268 М/12 В, а также Егччиа саготочога 268 МИ,Основной штамм Епеиа саго 1 очога 268, а также его варианты - штаммы 268 М, 268 М 12 Я хранятся в коллекции культур микроорганизмов Института микробиологии им, А, Кирхенштейна АН Лата, ССР, а вариант - штамм 268 М/ хранится в коллекции центрального музея промышленных микроУсловия выращивания инокулята: рН среды 6,8-7,0, температура 37 С, аэрация 0,5 объема воздуха на 1 объем среды, Пеногаситель-пропинол Б.После б ч роста культуральную жидкость в объеме 50 л из инокулятора передают в рабочий ферментер емкостью 1000 л с объемом культуральной жидкости 500 л. Введе 10 ние глюкозы в рабочий ферментер производят через 1,5 - 2,0 ч после засева. За этот период происходит полное потребление галактозы, оставшейся в культуральной жидкости инокулята, и одновременно синхронизация культуры. При этом глюкозу вводят в приточном режиме в концентрации и со скоростью, обеспечивающей потребление ее культурой, и поддержание ее остаточного содержания в культуральной жидкости, близкое к нулю. Условия культивирования 20 аналогичны таковым при выращивании инокулята.В ходе ферментации контролируют значение рН, прирост биомассы, удельную активность -аспарагиназы, потребление кислорода и содержание сахара. После 6-9 ч ферментации биомассу Епоиа саготочога отделяют центрифугированием для последующего выделения фермента. Получают 30 биомассу со средней удельной активностью фермента 20,4 МЕ/мг сухого вещества и выходом фермента 83,6 МЕ/мл среды, Выделение фермента из клеток осуществляют одним из известных способов. 35 источника углерода О-галактозу в количестве 0,9 - 1,1%. Это дает возможность получить биомассу с преиндуцированными системами синтеза аспарагиназы, При пеорганизмов Государственного НИИ стан- П р и м е р 1, Посевной материал Епмиа дартизации и контроля медицинских саготочога 268 выращивают в колбах на кабиологических препаратов им. Л. А. Тарасе- чалке (220 об/мин) при 37 С в течение 18 ч вича. на среде (по 50 мл в каждой колбе) следуюКультуры хранят на мясо-пептонном 40 щего состава, мас;%:агаре (2; агара) при комнатной температу- О-галактоза 1,0 ре 18-20 С) и пересевают через каждые 3-4 Сульфат аммония 0.5 мес. Для работы используют свежепересе- Фосфорная кислота 0,35 янную 12- или 24-часовую культуру, Едкий кали 0,65Посевнойматериал выращивают в колСульфат магния 0,02 бах на среде, содержащей О-галактозу в ка- Кукурузный экстракт 0,25 честве источника углерода в количестве Вода Остальное 0.9 - 1;1 мас, , и глутамат натрия в качестве Выращенный посевной материал в.коисточника аминного азота в количестве личестве 500 млиспользуютдлязасеваино,1 мас. Продолжительность выращива кулятора емкостью 100 л с 50 л среды ния посевного материала 16-20 ч. аналогичного состава, содержащей такжеИнокулят выращивают в культиваторе О-галактозу в качестве источника углерода, емкостью 100 л с объемом культуральной Условия выращивания; аэрация 0,5 объема жидкости 50 л, Для выращивания инокулята воздуха на 1 обьем среды, температура используют среду, содержащую в качестве 55 37 С, скорость вращения мешалки 390об/мин, продолжительность выращивания б ч, после чего всю культуральную жидкость из инокулятора передают в рабочий ферментер емкостью 1000 л с 500 л среды слеог .реходе к основной ферментации на глюкозе дующего состава, мас;:Сульфат аммонияФосфорная кислота водного раствора со скоростью 12,5 л/ч. Условия культивирования аналогичны Примеру "После 8 ч ферментации получают биомассу с удельной активностью-аспарагиназы 16,6 МЕ/мг сухого веса и выходом. фермента 84,8 МЕ/мл среды,0,5 0,35Едкий кали 0,65 Сульфат магния 0,02 Кукурузный экстракт 0,25 Вода Остальное рН 7,0 Условия культивирования: азрация 0,25 обьема воздуха на 1 обаем среды, температура 37 С, скорость вращения мешалки 190 об./Мин.Глюкозу подают в ферментер в приточном режиме 2 ч от начала культивирования в виде 7%-ного водного раствора со скоростью 12,5 л/ч, контролируя, чтобы остаточное содержание глюкозы в культуральной жидкости было близким к нулю, Общее. количество использованной глюкозы состав 51015 П р и м е р 4, Посевной материал и инокулят Елаа сагоючога 268 выращивают в условиях, аналогичных и римеру 1, Культуральную жидкость из инокулятора передают в рабочий ферментер емкостью 1000 л с 500 л среды, содержащей компоненты по примеру 1. Глюкозу подают в приточном режиме в виде 10%-ного водного раствора со скоростью 13 л/ч. Условия культивирования аналогичны примеру 1. После 6,5 ч ферментацию прекращают, Полученная биомасса обладает удельной аспарагиназной активностью, равной 5,4 МЕ/мг сухого веса, и выходом фермента 35,1 МЕ/мл среды.П р и м е р 5. Подготовка посевного материала и инокулята Епе 1 п 1 а саготочога 268 МЧ 1 аналогична примеру 1. Подачу культуральной жидкости из инокулятора и условия культивирования в.раббчем ферментере сохраняют по примеру 1. Глюкозу подают в приточном режиме в виде 5 О/-ного водного раствора со скоростью 13 л/ч. После 6,5 ч культивирования ферментацию прекращают. Полученная биомасса обладает удельной аспарагиназной активностью 22 МЕ/мг сухого веса, выход фермента 44,0 МЕ/мл среды.Предлагаемый способ получения-аспарагиназы при дробном введении глюкозы в среду обеспечивает выход биомассы с высокой удельной активностью до 21 МЕ/мг сухого вещества и саем фермента до 83,6 МЕ/мл; а также сокращение продолжительности ферментации до 8-11 ч.формула изобретения Способ получения :аспарагиназы, предусматривающий выращивание посевного материала и инокулята Егщпа саго 1 очога на среде, содержащей источники углерода, аминного азота, минеральную соль и воду с последующей азробной глубинной ферментацией на среде, содержащей источник азота, минеральные соли и воду, и выделением фермента, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения выхода и удельной активности фермента, выращивание посевного материала и инокулята ведут на среде, содержащей в качестве источника углерода 0-галактозу в количестве 0,9-1,1 мас.%, а ферментацию ведут на среде, содержащей в .качестве источника углерода глюкозу в ляет 1% среды 20 После 8 ч ферментации получают. биомассу с удельной активностью Е-аспарагиназы 23,0 М Е/мг сухого вещества и выходом - фермента 87.6 МЕ/мл среды. П р и м е р 2, Посевной материал Епанча саготочога 268 М 12 Й, выращенный в условиях, аналогичных примеру 1, в количестве 500 мл используют для засева инокулятора емкостью 100 л с 50 л среды, содержащей вания инокулята аналогичны примеру 1, После 6 ч роста всю культуральную жидкость инокулята передают в рабочий ферментер емкостью 1000 л с 500 л среды, содержаЩей компоненты по примеру 1. Глюкозув ферментер подают в приточном режиме через 1,5 ч с начала культивирования в виде 7%- ного водного раствора со скоростью 13 л/час, контролируя, чтобы остаточное со 35 40 держание глюкозы в культуральной жидкости было близким к нулю. Условия ферментации аналогичны примеру 1.После 6,5 ч ферментацииполучают биомассу Егвп 1 а саготочога с удельной активностью 1:аспарагиназы 21,8 МЕ/мг сухоговещества и выходом фермента 89,5 МЕ/млсреды,П р и м е р 3. Посевной материал Епап 1 а сагоючога 268 М выращивают на среде ив 50условиях, аналогичных примеру 1. 500 мл посевного материала используют для засева инокулятора емкостью 100 л с 50 л среды, содержащей компоненты по примеру 1; После 6 ч роста всю культуральную жидкость инокулята передают в основной ферментер емкостью 1000 л с 500 л среды, содержащей компоненты по примеру 1. Глюкозу начинают подавать через.2 ч с начала культивирования в приточном режиме в виде 7%-ного компоненты по примеру 1. Условия выращи1713929 Составитель В;СоинаТехред М,Моргентал гКорректор О,Кравцова Редактор Н,Яцола Заказ 661 Тираж .Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва. Ж, Раушская наб., 4/5. Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 суммарном количестве 0,9 - 1,1 мас., вводимую в среду после 1,5-2,0 Ч роста с концентрацией и скоростью, обеспечивающей поддержание ее остаточного сбдержания. в 8среде, близкого к нулю, в результате потребления ее культурой.в течение всего процесса ферментации,У